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背景：胃癌是威胁人类健康最常见的恶性肿瘤之一。在中国,胃癌发病率仍高居各种恶性肿瘤之首,且呈上升趋势。胃癌的发病过程是一个集遗传、环境及生活习惯等多因素于一体的复杂过程,其确切机制仍不清楚。深入探讨胃癌的发病机制,并有效应用于胃癌的早期预防与诊断对胃癌防治具有重要意义。
微小RNA(microRNAs,miRNAs)为近年来新发现的一类非编码单链小分子RNA,目前普遍认为它代表了一个新层次上的基因表达调控方式。miRNAs所介导的基因转录后调控方式的发现,使得人们对RNA调控基因表达的功能有了全新的认识,为肿瘤发病机制的研究开辟了新的领域和思路。
胃癌miRNAs表达的研究显示了它们在这一领域的重要性和潜在用途,一些miRNAs,如miR-9、miR-21、miR-27a、miR-143、miR-145、miR-433及miR-451等已被证实在胃癌中发挥重要的调控作用。let-7作为人类细胞或组织中发现较早的、存在较为广泛的miRNA,在人类miRNAs的功能研究中发挥了不容忽视的作用。let-7家族成员表达下调可见于肺癌、卵巢癌、淋巴瘤及头颈部鳞癌等多种肿瘤组织和细胞株中,并可通过调控细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭力的改变而参与肿瘤的发生发展,其表达水平有可能作为多种肿瘤临床诊断、病理分型及其预后的标志。
然而,作为常见恶性肿瘤之一的胃癌,let-7a是否与胃癌相关,并参与胃癌癌变过程及其机制的相关研究尚未有开展。本研究目的在于探讨let-7a在胃癌组织及细胞中的表达改变及其对胃癌发生发展的影响,以期为胃癌的发病机制研究开辟新的领域,为let-7a在胃癌的诊断、治疗及其早期防治领域的实践和应用提供实验依据。
材料与方法：
1、Trizol一步法提取细胞和组织中总RNA,采用分光光度计法分别检测RNA的浓度和纯度,采用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,对RNA进行相关的质量检测,采用探针法定量反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)分别检测let-7a在胃癌中心组织及其匹配癌旁正常组织、正常人胃粘膜上皮细胞与人胃癌上皮细胞株中的表达水平。
2、利用Lipofectamine-2000瞬时转染let-7a模拟物(mimic)和抑制剂(inhibitor)后,应用CCK-8法和流式细胞仪检测转染后细胞细胞增殖情况与细胞周期分布的变化；采用软琼脂集落形成试验检测转染let-7a mimic后肿瘤细胞非锚着依赖性生长能力的改变,并进一步通过裸鼠成瘤试验检测let-7a对肿瘤生长的影响。
3、通过生物信息软件预测和分析let-7a的靶基因；通过SYBR GREEN染料法qRT-PCR和蛋白质印迹法(Western blotting,WB)检测转染let-7a mimic和inhibitor后RAB40C在mRNA和蛋白质水平的改变,检测胃癌中心组织及其匹配癌旁正常组织、正常人胃粘膜上皮细胞与人胃癌上皮细胞株中RAB40C蛋白表达水平,分析let-7a表达水平与RAB40C蛋白表达水平的相关关系；结合体外靶基因3-非翻译区(3-untranslated region,3-UTR)荧光素酶报告基因活性检测,确定let-7a与RAB40C的靶向调控关系。
4、采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术,化学合成RAB40C小片段干扰核糖核酸(small interfering RNA,siRNA),干扰RAB40C基因在mRNA和蛋白水平的表达,通过CCK-8细胞增殖试验和软琼脂集落形成试验检测共转染RAB40CsiRNA和let-7a mimic与单独转染let-7a mimic后,细胞增殖率和软琼脂克隆形成率的差异,以确定RAB40C是否参与了let-7a对胃癌细胞增殖与生长的调控作用。
结果：
1、27例胃癌肿瘤中心组织与其匹配癌旁正常组织中let-7a表达水平定量分析结果显示,有78％(21/27)的胃癌患者,其肿瘤中心组织中let-7a表达水平较癌旁正常组织显著降低；人胃癌上皮细胞株MKN-28、AGS、SGC-7901、BGC-823和HGC-27中let-7a表达水平与人正常胃粘膜上皮细胞GES-1相比显著降低,差异均有统计学意义(P＜0.05)；let-7a表达水平降低与组织和细胞分化程度相关,分化程度越低,let-7a表达下降越明显。
2、转染let-7a mimic至胃癌上皮细胞株AGS和BGC-823,与转染let-7a mimic NC组相比,细胞增殖率明显降低,G1期细胞比例增加,S期细胞比例减少；而GES-1细胞转染let-7a inhibitor后,细胞增殖率显著升高,G1期细胞比例降低,而S期细胞比例增加,差异均有统计学意义(P＜0.05)。
3、转染let-7a mimic的AGS和BGC-823细胞软琼脂集落形成率显著低于转染let-7a mimic NC和未转染细胞,克隆形态学观察发现转染let-7a mimic细胞形成的克隆显著小于转染let-7a mimic NC和未转染细胞；裸鼠成瘤试验结果发现,与接种转染let-7a mimic NC的细胞或未转染细胞的动物组相比,接种转染let-7a minlic细胞的裸鼠组,其成瘤潜伏时间长,肿瘤的生长速度缓慢,肿瘤体积和重量均较对照组小,差异均有统计学意义(P＜0.05)。
4、在AGS和BGC-823细胞中,转染let-7a mimic组RAB40C蛋白表达水平与转染mimic NC组和未转染组比较,显著降低；在GES-1细胞中,转染let-7a inhibitor组RAB40C蛋白表达水平与转染inhibitor NC组和未转染组相比显著升高；但RAB40CmRNA的表达水平在转染let-7a mimic或let-7a inhibitor后均未改变,差异无统计学意义(P＞05)；27例胃癌肿瘤中心组织与其匹配癌旁正常组织和GES-1、MKN-28、AGS、SGC-7901、BGC-823和HGC-27细胞中,let-7a的表达水平与RAB40C蛋白表达水平之间存在负相关关系,let-7a的表达水平越高,其RAB40C蛋白表达水平越低；双荧光素酶报告基因活性检测结果表明,共转染野生型psiCHECK-RAB40C表达载体与let-7a mimic后,荧光素酶相对活性下降,而共转染野生型psiCHECK-RAB40C表达载体与let-7a inhibitor后,荧光素酶相对活性上升了30％；在突变型psiCHECK-RAB40C表达载体与let-7a mimic和inhibitor共转染体系中均未观察到荧光素酶相对活性的改变。
5、采用RNA干扰技术,设计并化学合成RAB40C siRNA,成功沉默了RAB40C基因在mRNA和蛋白水平的表达；在AGS和BGC-823细胞中,转染let-7a mimic组与未转染组比较,细胞增殖率和软琼脂克隆形成率均显著降低,而将RAB40C siRNA与let-7a mimic共转染入细胞,其细胞增殖率和软琼脂克隆形成率低于未转染组,但均显著高于let-7a mimic与RAB40C siRNA NC共转染组及let-7a mimic单独转染组,说明干扰RAB40C的表达可在一定程度上恢复let-7a对细胞增殖和锚着非依赖性生长的影响,提示RAB40C参与了let-7a对胃癌上皮细胞生长抑制作用的调控,进一步证实RAB40C基因是let-7a的功能性靶基因。
结论：
1、本研究从细胞和组织水平检测分析,发现胃癌组织和胃癌细胞株中let-7a表达水平均显著下降,且let-7a表达水平与肿瘤组织和细胞的分化程度相关,初步提示let-7a可能在胃癌发生发展过程中发挥重要作用,预示let-7a表达应用于胃癌临床诊断与病理分级领域的可能性。
2、本研究首先通过体外试验,发现let-7a表达水平增高可导致细胞增殖能力受到抑制,同时影响细胞周期的分布,导致细胞G1期阻滞；抑制了胃癌细胞株的非锚着依赖性生长能力；体内裸鼠成瘤试验进一步证实let-7a表达水平增高可抑制肿瘤的生长,表现在肿瘤潜伏时间的延长、肿瘤生长速度的减慢,肿瘤重量的降低。本研究首次从体内外水平发现并证实let-7a可在胃癌发生过程中发挥的抑癌基因作用,这是对胃癌发生机制和let-7a与肿瘤关系研究的重要补充。
3、RAB40C作为RAS基因家族成员之一,在本研究中首次从体内外水平被证实为let-7a的靶基因,let-7a可通过与RAB40C3-UTR结合,在转录后水平调节RAB40C蛋白表达；同时我们也证实RAB40C不仅受到let-7a的调控,且在let-7a对胃癌细胞增殖和生长的调控过程中发挥重要作用,为let-7a的功能性靶基因,该结果进一步完善了let-7a的作用机制和作用通路,为let-7a作为肿瘤基因治疗的靶点和抑癌药物的开发与应用提供了重要的实验依据。