论文部分内容阅读
CA125是由Bast[1]等于1983年发现并命名，其血清学水平在卵巢癌等恶性肿瘤病人异常升高。CA125自发现以来一直作为卵巢癌常规筛查、辅助诊断及疗效评估的肿瘤标志物[2]。目前临床检测及基础实验研究等所用CA125抗体大多是依靠进口，价格昂贵，检测成本高，限制其在临床的进一步应用。因此，建立快速、高效、经济的制备CA125抗体的方法，对CA125试剂盒开发及相关基础研究都具有重要的意义。目的：1.建立快速高效经济的CA125串联重复序列（CA125R）原核表达系统，表达、分离纯化CA125R蛋白并鉴定。2.制备兔抗CA125R蛋白的抗血清，分离纯化多克隆抗体并鉴定其识别天然CA125蛋白的特异性。3.制备鼠抗CA125R蛋白的单克隆抗体，并鉴定其识别天然CA125糖蛋白的特异性。方法：1.全基因合成一段CA125串联重复序列（CA125R），并将此片段连接至pGEX-6P-1及pET-32a(+)原核表达载体，构建重组原核表达质粒pGEX/CA125R及pET/CA125R。2.分别将pGEX/CA125R和pET/CA125R转化至大肠杆菌BL21（DE3），确定最佳表达条件后，诱导表达重组蛋白，分别经GST亲和层析和镍离子亲和层析系统分离纯化重组蛋白，并鉴定所纯化的重组蛋白。3.将纯化的重组CA125R蛋白免疫新西兰大白兔，制备抗血清，经蛋白A抗体纯化系统分离纯化多克隆抗体，并鉴定。4.将纯化的重组CA125R蛋白免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合，筛选阳性克隆，并进一步克隆化，建立稳定分泌抗CA125单克隆抗体杂交瘤细胞系，采用小鼠腹水诱生法大量制备单克隆抗体，制备的抗体经蛋白A纯化系统纯化并鉴定。结果：1.经基因重组技术，成功建立CA125R原核表达系统，分别通过GST亲和层析及镍离子亲和层析系统分离纯化得到GST-CA125R和TRAX-CA125R重组蛋白。2.将纯化的TRAX-CA125R重组蛋白免疫家兔，制备其抗血清，并经纯化得到其多克隆抗体，多克隆抗体经Western blot验证能特异识别天然CA125糖蛋白，具有应用价值。3.将纯化的GST-CA125R重组蛋白免疫BALB/c小鼠，采用杂交瘤技术，将免疫的小鼠脾细胞和SP2/0细胞进行融合，成功获得一株稳定分泌抗CA125单克隆抗体的杂交瘤细胞株，经腹水诱生及纯化获得高纯度的抗CA125单克隆抗体。结论：采用基因重组技术，成功建立快速经济高效的重组CA125R原核表达系统，纯化获得了高纯度的重组CA15R蛋白；以纯化的TRAX-CA125R蛋白为免疫原，制备了兔抗CA125多克隆抗体，制备的抗体能特异识别天然CA125糖蛋白；以GST-CA125R蛋白为免疫原，成功获得一株稳定分泌抗CA125单克隆抗体的杂交瘤细胞株，制备了高纯度的单克隆抗体，为以后的相关基础研究和临床试剂盒开发奠定了基础。