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随着生物技术的发展,转基因技术已经成为培育植物新品种的重要手段,许多重要性状已经通过此方法应用于生产。与此同时,公众对标记基因及其产物安全性的质疑也成为植物转基因面临的一个重要问题。所以,构建环境友好型的安全转化载体,有效控制目的基因的表达是当前植物转基因的一个发展趋势。本研究利用逆境诱导型启动子构建植物表达载体,通过安全的木糖筛选系统,用于对百脉根(Lotus cirniculatusL.)进行转化,以期提高百脉根的耐盐性。
该载体以来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的木糖异构酶基因XylA为选择标记基因。木糖异构酶(葡萄糖异构酶)广泛分布于动物和部分植物体内,而且大量应用于食品工业中,以该基因为选择标记,不存在安全性问题。该基因是以大肠杆菌基因组DNA为模板,根据报道的基因序列设计引物,用PCR方法克隆获得。经序列比较,该基因序列与报道的序列同源性为100%,其编码框全长1323bp,编码440个氨基酸。
该载体利用拟南芥(Arabidopsis thaliana)逆境诱导型的rd29A启动子驱动目的基因——耐盐基因HAL1。根据报道序列设计引物,从拟南芥基因组中克隆了rd29A启动子,与报道的序列同源性为99%。该启动子序列为865bp,含有2个DRE元件和4个ABARE元件。以该启动子驱动gus表达,染色结果表明该启动子受高盐、高渗等逆境和ABA诱导。
本研究建立了农杆菌介导的基于木糖选择系统的百脉根转化体系。以百脉根子叶为外植体,抑菌、分化、筛选培养基均为MSO附加15g/L木糖、5g/L蔗糖、0.1mg/L 6-BA和500 mg/L头孢霉素或MSO附加20g/L木糖、0.1mg/L 6-BA和500 mg/L头孢霉素,再生苗生根筛选培养基为MSO附加30g/L木糖。通过这套程序,获得了HAL1转基因百脉根植株,经耐盐性鉴定其NaCl抗性为1.0%,比野生型(0.8%)抗性提高25%。在1.3%NaCl条件下,转基因植株仍能生根。