华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)病又称肝吸虫病,全球约3500万人感染,其中中国有超过1200万人感染。人或其他哺乳动物由于食用生或半生被囊蚴感染的鱼虾而感染此病。华支睾吸虫囊蚴经过一个月便可以在宿主体内发育为成虫,成虫寄生于人体胆管及胆囊中,可引起肝脏受损,进而导致肝胆疾病及混合细菌感染等。儿童和青少年感染华支睾吸虫后,临床表现较重,除肝胆症状外,常伴有营养不良、贫血、低蛋白血症、浮肿和发育障碍,是一种危害严重的人兽共患寄生虫病。现阶段对于华支睾吸虫的检测,目前所使用的加藤厚涂片法存在漏检,误检等缺陷。实验室常用的分子生物学检测的方法有传统PCR、巢式PCR、荧光定量PCR等,免疫学检测方法普遍为ELISA。但这些传统的分子生物学及免疫学检测方法成本较高、操作繁琐、耗费时间较长,进而无法满足基层实地快速化检测。因此,开发低成本、操作简便、检测时间短的华支睾吸虫检测方法,可以大大提高华支睾吸虫检测效率,并为华支睾吸虫的防控提供新的方法和技术支持。本研究针对华支睾吸虫ITS-2基因序列的6个区域设计4条引物,并对该体系的灵敏度、特异性等进行验证后初步建立了华支睾吸虫环介导等温扩增(LAMP)检测方法。另外针对华支睾吸虫COX-1基因序列设计2条长链引物,并对该体系的灵敏度、特异性等进行验证后初步建立了华支睾吸虫重组酶聚合酶扩增(RPA)检测方法。利用上述建立的LAMP检测方法中的2条短链引物建立了一套华支睾吸虫普通PCR检测方法,并验证普通PCR体系可检测的华支睾吸虫DNA最低浓度。通过对松花江各支流进行实地采集鱼样并用人工模拟胃液消化法收集华支睾吸虫囊蚴,完成了比格犬人工感染实验。随后我们利用已知阳性样本和阴性样本来验证LAMP和RPA技术实际运用于华支睾吸虫检测时的有效性和准确性,并对比分析二种方法的检测步骤及结果,以进一步评测两种方法应用于检测华支睾吸虫感染的可行性。结果显示,本研究建立LAMP检测方法可检测到华支睾吸虫最低DNA浓度为90 pg/μL,与旋毛虫、东方次睾吸虫、台湾次睾吸虫、隐孢子虫等无交叉扩增反应。RPA检测方法可检测到华支睾吸虫的最低DNA浓度为2 ng/μL,与旋毛虫、东方次睾吸虫、台湾次睾吸虫、隐孢子虫等无交叉扩增反应。利用LAMP短链引物建立的普通PCR可检测到华支睾吸虫最低DNA浓度为11 ng/μL。本研究中LAMP检测的灵敏度约为普通PCR检测的120倍,RPA检测的灵敏度约为普通PCR检测的5倍。在对实际样品的检测中,通过添加核酸染料Sybr Green I,LAMP及RPA均可以在脱离PCR仪及紫外凝胶系统的条件下,快速地检测出华支睾吸虫囊蚴及虫卵。综上,本研究建立的华支睾吸虫LAMP检测方法与RPA检测方法具有良好的特异性、灵敏性等。两种体系均能够快速检测出华支睾吸虫的感染情况,具有较好的应用前景。