【摘 要】
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CRISPR/Cas系统是发现于细菌中的免疫防御系统,由此构建的CRISPR/Cas9系统现已成为应用广泛的基因编辑技术。CRISPR/dCas9系统是由CRISPR/Cas9系统改造而成的,将Cas9蛋白基因突变,使Cas9核酸切割功能丧失,成为缺陷型Cas9蛋白（deadCas9,dCas9）,如将荧光蛋白与dCas9蛋白融合,即可实现定位靶序列但又不切割靶序列的新功能。CRISPR/dCas
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CRISPR/Cas系统是发现于细菌中的免疫防御系统,由此构建的CRISPR/Cas9系统现已成为应用广泛的基因编辑技术。CRISPR/dCas9系统是由CRISPR/Cas9系统改造而成的,将Cas9蛋白基因突变,使Cas9核酸切割功能丧失,成为缺陷型Cas9蛋白（deadCas9,dCas9）,如将荧光蛋白与dCas9蛋白融合,即可实现定位靶序列但又不切割靶序列的新功能。CRISPR/dCas9技术自建立以来主要用于分子互作的筛选和验证以及各种基因功能的研究。将该系统应用于活细胞染色体标记能有效促进染色体动力学的可视化,由此增加人们对细胞核内动态过程的理解。但是目前CRISPR/dCas9技术在染色体标记方面应用较少,而在斑马鱼物种中的应用更是鲜有报道。故本论文对使用CRISPR/dCas9系统荧光标记斑马鱼染色体的方法进行了初步研究。首先,我们设计了特异性结合于斑马鱼第25号染色体两个重复区域的sgRNA序列,重复区域碱基位置位于5226 bp-8900 bp和37463691 bp-37496321 bp。后通过显微注射将sgRNA质粒和dCas9质粒共同打入斑马鱼一细胞期胚胎,并在胚胎不同时期进行倒置荧光显微镜观察,发现在原肠期质粒开始表达绿色荧光蛋白,1号sgRNA和dCas9质粒共注射组卵裂球区域出现集中绿色荧光。为了更清晰地观察到单个细胞绿色荧光情况,我们后又使用了细胞瞬时转染的方法,尝试将sgRNA质粒和dCas9质粒共转染斑马鱼ZEM-2S细胞系,并对转染条件进行了优化。研究发现在使用Neofect转染试剂、转染试剂与质粒比例为1.5:1、sgRNA和dCas9浓度比例为2:1时,瞬时转染36h荧光标记效果最好。实验成功标记了斑马鱼第25号染色体碱基位置5226 bp-8900 bp重复区域,为之后流式分选染色体,构建斑马鱼特异性染色体文库奠定了研究基础。
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