UPLC-PDA/UHPLC-Q-TOF-MS分析六大茶类中的酚酸类物质

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酚酸是一类分子中具有羧基和羟基的芳香族化合物。茶叶中酚酸主要有没食子酸、鞣花酸、咖啡酸、绿原酸、对香豆酸、茶没食子素、间双没食子酸、异绿原酸、对香豆酰-3-奎尼酸,它们具有重要的生物活性和较高的生物利用度。因茶叶中茶多酚含量占18%~36%,儿茶素及其氧化产物又占茶多酚总量的70%以上,对茶叶中低含量的酚酸类物质检测带来极大的干扰。目前对酚酸的研究主要集中在中草药、水果、蔬菜、谷物等领域,而对茶叶中酚酸类物质的分布及含量缺乏系统研究。为了实现对六大茶类中的酚酸类化合物的定量分析及六大茶类判别分类,本研究共收集了六大茶类茶叶样品175个,比较了不同提取条件下对酚酸类化合物的浸提率的影响,得出最佳提取条件组合,利用超高效液相色谱法(UPLC-PDA)测定了茶叶中的没食子酸(GA)、绿原酸(CA)、对香豆酸(p-Co A)、咖啡酸(CafA)、鞣花酸(EA)等五种酚酸的含量,比较分析了不同茶类中酚酸的含量差异,结合液质联用技术(UHPLC-Q-TOF-MS)对六大茶类中主要的酚酸及其衍生物进行了初步定性定量。论文主要取得了以下结果:(1)茶叶中酚酸浸提工艺优化:比较了纯水、甲醇、70%丙酮、5%甲酸水、5%乙酸水、甲酸:甲醇(5:95,v/v)、乙酸:甲醇(5:95,v/v)、95%乙醇等溶剂对酚酸浸提的影响,发现甲酸:甲醇(5:95,v/v)可以得到优于其他溶剂的酚酸提取率。结合响应面优化,筛选出浸提酚酸类物质的最佳条件组合为:0.2g茶粉,9mL甲酸:甲醇溶剂(5:95,v/v),50℃水浴浸提65min。(2)优化并建立了茶叶中五种酚酸的UPLC定量方法:ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(1.8μm 2.1×150mm);流动相A,乙腈:水体系(5:95,v/v);流动相B,添加0.1%甲酸的水:乙腈体系(5:95,v/v);流速:0.4 mL/min;柱温:30℃;样品盘温度:20℃;进样量:2μL;紫外双波长检测:280nm、326nm。4℃条件下,24h内样品稳定性RSD为0.286~2.559%、方法重复性RSD在1.975~2.826%、加样回收率在 82.37~108.33%。(3)以外标法定量,六大茶类175个样品中的GA含量在0.16~0.69 mg/g,CA含量在 0.07~0.16 mg/g,Caf A 含量在 0.03~0.05 mg/g,p-Co A 含量在 0.09~0.16 mg/g,EA含量在0.41~0.79 mg/g。五种酚酸在六大茶类中的含量存在显著差异。(4)建立了六大茶类中多种酚酸类物质UHPLC-Q-TOF-MS定性定量方法:使用 ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱(1.8μm 2.1 ×50mm)。流动相 A:含 0.1%甲酸的乙腈:水体系(5:95,v/v),流动相B:含0.1%甲酸的水:乙腈体系(5:95,v/v);流速:0.3 mL/min;柱温:30℃;进样量:2μL。茶叶中酚酸进行targeted MS/MS分析,共鉴定得得1 1种酚酸及其衍生物和奎尼酸。(5)应用标准品对六大茶类30个茶样中的酚酸GA、CA、p-Co A、CafA、EA和酚酸合成前体成分奎宁酸分别进行了外标法定量,其含量分布分别为0.099~2.027 mg/g,0.036~0.253 mg/g,0.012~0.558mg/g,0.015~0.090 mg/g,0.141~1.393 mg/g和0~0.379 mg/g;利用 GA 标准曲线对 methyl gallate,galloylglucose isomer,digalloylglucose,theogallin,p-coumarylquinic acid 等五种酚酸和水解单宁 strictinin 进行了相对定量,在它们的含量分别为0~0.07 mg/g,0~0.63mg/g,0~0.275 mg/g,0~0.054 mg/g,0~0.005 mg/g 和 0~0.282 mg/g。(6)运用SIMCA-P 13.0和SPASS 19.0分别对超高效液相色谱与液质联用二级质谱的酚酸定量数据进行主成分分析和Bayes判别分析,UPLC所测得GA、CA、p-Co A、CafA和EA等5个指标的初始判别率为62.3%;结合UHPLC-Q-TOF-MS定性定量的11种酚酸及其衍生物和奎尼酸共12个指标建立判别模型,初始判别率达100%。研究结果显示在六大茶类即红茶、黑茶、乌龙、白茶、黄茶、绿茶中均含有不同种类数量的酚酸类物质,且在各类茶叶中含量存在差异。这种差异可能与茶树品种、产地和加工方式等有关。研究结果初步表明,茶叶中的酚酸分布及含量的差异可以作为参考指标之一,用于茶叶的化学分类。
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