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类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一类原因不明的慢性、进行性自身免疫疾病,以关节慢性炎症为主要表现,炎症关节局部常常有严重的关节破坏和骨丢失。关节骨质侵蚀成为近年来RA研究的特点之一,对RA的治疗侧重于快速有效控制病情,阻止长期病情对关节结构和功能的损坏,抑制破骨细胞性骨破坏和炎症性骨丢失。RA病灶部位有大量的成熟破骨细胞提示破骨细胞是导致关节侵蚀的主要细胞,其数量和功能决定了RA关节破坏与骨丢失的严重程度。甲氨喋呤（Methotrexate,MTX）是治疗类风湿性关节炎的首选药物,可调节患者的异常免疫功能,在关节炎的病理改变上,MTX可减少骨质侵蚀,阻止或延缓关节破坏,减少残疾,对早期控制病程进展比较有益。但小剂量MTX治疗RA的机制仍然不是很清楚。本实验分析研究了MTX对小鼠破骨细胞的影响,试图揭示MTX控制类风湿性关节炎骨破坏以破骨细胞为靶细胞的可能作用机制,为MTX的临床应用提供科学依据。本文采用MC3T3-E1小鼠成骨细胞株与C57BL/6小鼠原代骨髓细胞共培养体系。MC3T3-E1小鼠成骨细胞株传代培养后,消化重悬。6～8周龄雄性C57BL/6小鼠处死后,无菌取股骨和胫骨,收集骨髓单核细胞,加入培养液重悬。在培养皿中分别加入密度为1×106cells·mL-1的MC3T3-E1及密度为2×107 cells·mL-1的骨髓前体细胞共培养。两天后半量换液,并加入终浓度280 ng·mL-1的IL-1β和终浓度10 ng·mL-1的M-CSF诱导破骨细胞生成,继续培养2天收集破骨细胞,置于新的培养皿中进行纯化培养。分别设置空白对照组,IL-1β对照组,IL-1β联合浓度为0.01～10μmol·L-1的MTX用药组,观察药物对纯化破骨细胞的作用。研究采用MTT法测定甲氨喋呤对破骨细胞增殖作用的影响;流式细胞术测定甲氨喋呤对破骨细胞调亡的影响;TRAP染色和骨吸收陷窝染色记数、骨吸收陷窝面积测定分别观察甲氨喋呤对破骨细胞活性及功能的影响;收集48h细胞培养上清,ELISA法测定甲氨喋呤对破骨细胞MMP-9分泌的影响;提取破骨细胞RNA,RT-PCR法测定甲氨喋呤对破骨细胞中MMP-9、RANK基因表达的影响。结果:光镜下,观察共培养体系的细胞形态,可见纯化的破骨细胞表现出体积大、多核、伪足以及TRAP染色阳性等破骨细胞特征。骨片上,形成典型的骨吸收陷窝以及破骨细胞级鞍谆?证明本次实验建立的共培养体系可以成功诱导出具有骨吸收功能的破骨细胞。MTT法测定破骨细胞增殖的结果表明,MTX对破骨细胞增殖的抑制作用,呈现出一定的剂量依赖性,随着浓度的升高,其抑制作用增强。0.01μmol·L-1的MTX对破骨细胞活性没有抑制作用。0.1～10μmol·L-1MTX都具有抑制破骨细胞增殖的作用,其中0.1μmol·L-1和1μmol·L-1的MTX处理组的破骨细胞增殖水平显著低于空白对照组,10μmol·L-1MTX处理组的破骨细胞增殖水平最低,与空白对照组相比差异极显著。流式细胞术测定破骨细胞凋亡结果表明,IL-1β显著抑制破骨细胞凋亡。MTX处理组则表现出明显的诱导破骨细胞凋亡作用,0.01μmol·L-1和0.1μmol·L-1的MTX处理组,破骨细胞凋亡比例略低于空白对照组,但是仍然高于IL-1β处理组,表现出诱导破骨细胞凋亡作用。1μmol·L-1和10μmol·L-1的MTX可以完全拮抗IL-1β的抑制凋亡作用,破骨细胞凋亡比例显著增加,甚至高于空白对照组,证明随着浓度升高,MTX诱导破骨细胞凋亡的作用增强。Hoechst染色法进行破骨细胞凋亡形态学观察,其结果也显示出同样的趋势。ELISA法测定破骨细胞MMP-9分泌结果表明,MTX只在较高浓度水平对IL-1β刺激的MMP-9分泌有抑制作用,在低浓度水平则没有作用甚至出现相反的作用趋势。破骨细胞骨吸收功能测定结果表明,IL-1β处理组破骨细胞计数,骨吸收陷窝计数,骨吸收陷窝平均面积以及骨吸收陷窝总面积,四个指标均高于空白对照组,表明IL-1β可以显著提高破骨细胞骨吸收功能。MTX处理组,在这四个指标上均可拮抗IL-1β作用,显示出抑制破骨细胞骨吸收功能结果,其抑制作用呈现出一定的浓度依赖性。对RT-PCR电泳图像的分析结果表明,IL-1β可显著刺激破骨细胞中RANK、MMP-9的mRNA的表达。MTX在0.01μmol·L-1至10μmol·L-1时均可抑制IL-1β对破骨细胞RANK的mRNA表达的刺激作用,在1μmol·L-1至10μmol·L-1其抑制作用与IL-1β对照组相比差异显著。MTX只在1μmol·L-1至10μmol·L-1时对IL-1β刺激的破骨细胞MMP-9的mRNA表达具有抑制作用。综上所述,本研究结果显示,IL-1β显著抑制破骨细胞凋亡并增强其骨吸收功能。同时可显著刺激破骨细胞中RANK、MMP-9的mRNA的表达,在破骨细胞培养48h时,可显著刺激破骨细胞金属基质蛋白酶MMP-9的分泌,在破骨细胞分化激活中具有重要作用。MTX可拮抗IL-1β对破骨细胞的作用,对IL-1β诱导生成的破骨细胞,具有抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,显著促进破骨细胞骨吸收功能的作用,并呈现出一定的浓度依赖性。初步证明MTX降低炎症性骨破坏的作用与其抑制破骨细胞的增殖及功能有关,研究结果还提示MTX对破骨细胞产生抑制作用有可能通过影响RANKL-RANK细胞因子体系实现。