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研究背景糖尿病是一种慢性代谢疾病,其中2型糖尿病的患病人数占糖尿病患病人群的90%以上,胰岛素抵抗和胰岛β细胞损伤是2型糖尿病最主要的病理生理机制。肥胖是诱发2型糖尿病的最主要的原因,有超过80%以上的2型糖尿病患者属于肥胖人群(BMI>35kg/m2)。机体处在肥胖状态时,体内脂肪细胞膨胀,会产生大量的游离脂肪酸,这些游离脂肪酸会诱导体内产生炎症并使炎症细胞产生大量的炎症因子与趋化因子,最终造成组织和系统性胰岛素抵抗,但游离脂肪酸诱导的胰岛β细胞损伤的分子机制还有待研究。丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)参与调控体内多种应激反应。有研究表明MAPK家族可以通过调控内质网应激、炎症反应、胰岛素抵抗与胰岛素分泌等多种信号通路影响2型糖尿病的发病过程,但MAPK家族对糖脂毒性诱导的胰岛β细胞损伤的作用机制还未完全阐明。丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶(MAPK phosphatase,MKP),可以通过特异性去除苏氨酸和酪氨酸的磷酸化负向调控MAPK的活化。MKP-5作为第三类MKPs,已经有文献报道MKP-5被干扰后,可以加剧白色脂肪和肝脏内的炎症反应,并由此产生胰岛素抵抗,提示着MKP-5可能参与调控2型糖尿病的发病过程,但MKP-5是否可以调控糖脂毒性诱导的胰岛β细胞功能紊乱和凋亡还尚未可知。实验目的本研究通过改变原代胰岛细胞和MIN6胰岛β细胞系中MKP-5的表达,探究MKP-5对于糖脂毒性诱导的胰岛细胞损伤的作用及其分子机制。实验方法:构建高脂饮食(Hight feed diet,HFD)肥胖小鼠模型,提取胰腺组织蛋白,并用Western blot法检测MKP-5的表达变化。用pcDNA3.1-MKP5质粒转染MIN6细胞,构建MKP-5稳定过表达的MIN6细胞系(MIN6-MKP5),以转入pcDNA3.1空载体的细胞(MIN6-PC)作为对照。同时用表达MKP-5的腺病毒(Ad-MKP5)感染MIN6细胞,上调MKP-5的表达水平。上述细胞用GP处理后,通过Annexin-V/PI双染法与Hoechst33258法分析细胞凋亡率。用Western blot、实时荧光定量PCR检测促炎因子的表达水平以及胰岛β细胞功能及凋亡相关蛋白和MAPK家族蛋白的激活或表达情况。GSIS检测MIN6细胞胰岛素分泌水平,ELISA法分析促炎因子的分泌水平。用特异性干扰MKP-5表达的siRNA(si-MKP5)或其对照siScramble(si-SC)转染MIN6细胞后,用GP处理,通过Annexin-V/PI双染法分析其凋亡率,并用Western blot法检测胰岛β细胞功能及凋亡相关蛋白和MAPK家族蛋白的激活或表达情况,GSIS分析MIIN6细胞胰岛素的分泌水平。分离HFD小鼠原代胰岛细胞,并分别用Ad-MKP5腺病毒感染或si-MKP5转染原代胰岛细胞,改变细胞中MKP-5的表达水平,并用Western blot法检测胰岛功能与凋亡相关蛋白的激活或表达水平。SiMKP5转染MIN6细胞48h后,用P38、JNK或ERK抑制剂预处理细胞联合应用GP后,用Western blot法检测P38、JNK、ERK活化水平及胰岛细胞功能和凋亡相关的蛋白活化或表达情况。实验结果(1)在小鼠胰腺组织中,发现HFD小鼠中MKP-5的表达水平明显低于对照小鼠。(2)在MIN6细胞中,MKP-5过表达可以抑制GP诱导的细胞凋亡,其中线粒体凋亡途径相关蛋白(BCL-2、BAX、caspase-3,-9与PARP-1)和内质网应激凋亡途径相关蛋白或基因(GRP-94、IRE-1α、eIF2-α、XBP-1s、CHOP与caspase-12)与MKP-5的调节作用密切相关。同时MKP-5被干扰会通过内质网应激凋亡途径和线粒体凋亡途径加剧GP引起的胰岛β细胞凋亡。然而,GP刺激和MKP-5的表达并不影响MIN6细胞中死亡受体途径相关蛋白(caspase-8)的激活。(3)MKP-5过表达可以改善由GP引起的MIN6细胞功能紊乱,表现为提高胰岛β细胞胰岛素分泌功能,并缓解胰岛β细胞功能相关蛋白或基因(AKT、GLUT2、PDX-1、GCK)表达量。此外,MKP-5被抑制会加剧GP造成的胰岛素分泌和胰岛β细胞功能相关蛋白的低表达。(4)在MIN6细胞中MKP-5过表达能够抑制GP刺激的促炎因子(IL-1β、TNF-α与IL-6)和趋化因子(MCP-1)的分泌和表达。(5)在原代胰岛细胞中,MKP-5过表达可抑制肥胖诱导的凋亡相关蛋白的活化,提高胰岛功能相关蛋白的表达。干扰MKP-5可以加剧肥胖相关的凋亡和胰岛细胞功能紊乱。(6)在MIN6细胞中MKP-5过表达对GP诱导的MAPK家族蛋白P38,JNK和ERK的活化具有抑制作用,且呈现时间依赖性。相对比抑制MKP-5的表达水平,会上调GP刺激的MAPK家族蛋白的活化。进一步使用P38、JNK或ERK抑制剂及si-MKP5处理MIN6细胞,结果证实,在胰岛细胞中,P38和JNK MAPK是MKP-5调控高糖高脂诱导的凋亡和功能紊乱的底物分子蛋白。结论及意义MKP-5通过调节P38和JNK MAPK信号通路发挥调节高糖高脂诱发的胰岛β细胞凋亡和功能紊作用。本研究的完成为2型糖尿病的发病机制研究提供了更多理论基础,并为治疗2型糖尿病提供了潜在的新靶点。创新性(1)探究MKP-5对糖脂毒性诱导的MIN6细胞与小鼠原代胰岛细胞功能紊乱和凋亡的调节作用。(2)探究MKP-5-MAPK信号通路参与糖脂毒性诱导的MIN6细胞功能紊乱和凋亡的调控作用。