在全球范围内,中枢神经系统的恶性肿瘤发病率为2.6～3.7/10万居民/年,在脑恶性肿瘤中,弥漫性胶质瘤(Glioma)最常见,约占胶质细胞起源的原发性脑肿瘤的30%。在人类,星形细胞瘤是最常见的胶质瘤。根据2007 年中枢神经系统肿瘤世界卫生组织(World Health Organization,WHO)分类,弥漫浸润型星形细胞瘤可以分为三级:弥漫型星形细胞瘤(Ⅱ级)、间变型星形细胞瘤(Ⅲ级),胶质母细胞瘤(Ⅳ级)。胶质瘤患者的平均总生存时间约为20至36个月,而恶性程度最高的患者生存时间不超过14个月;在复发性恶性胶质瘤的病例中,尽管经过积极治疗,肿瘤进展的平均时间也仅为8周。目前胶质瘤的治疗方法是手术结合化疗和/或放疗。在过去的十年里,神经外科医生利用先进的术中成像方法、基于荧光的肿瘤生物标志物和实时突变分析来最大化肿瘤切除的范围。此外,通过结合使用刺激-绘图技术、皮质脊髓束成像和立体定向热消融,可以进一步改进并尽量减少围手术期的发病率。然而,许多胶质瘤患者仍表现出对这些干预措施的高抵抗性,而且频繁复发。因此,探寻胶质瘤发生发展的相关分子机制并试图寻找新的治疗靶点意义重大。KIF20A,也被称为RAB6KIFL/MKlp2,驱动蛋白kinesin6家族成员,一种微管相关的马达蛋白,最初被发现定位于高尔基体,并通过与Rab6的三磷酸鸟苷(GTP)结合形式的相互作用在该细胞器中发挥重要功能。它在有丝分裂的最后一步参与胞质分裂;还参与细胞间期从高尔基体到内质网进行逆行性囊泡转运过程。KIF20A蛋白是由E2F-视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)-p16通路控制的,它广泛表达的信使核糖核酸(mRNA)存在于胎儿和成人组织中。KIF20A属于有丝分裂细胞中积累的一类运动蛋白,微注射抗KIF20A抗体会导致细胞分裂失败。据报道驱动蛋白家族成员KIF20A的异常功能在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用,在多种肿瘤中过表达。有研究显示通过小干扰RNA干扰胰腺癌细胞KIF20A的表达后,可以显著抑制肿瘤细胞的生长。此外,KIF20A通过将人胰岛素样生长因子2-mRNA结合蛋白3(IGF2BP3)和IGF2BP3结合转录物沿微管运输到细胞突起,从而促进胰腺癌细胞的活力和侵袭性。KIF20A在多种肿瘤中的表达特性说明它可能成为肿瘤诊断与治疗的潜在靶点。已经有研究证明KIF20A是一种新的肿瘤相关抗原(TAA),是一种新型表达KIF20A的胰腺癌细胞抗癌免疫治疗的潜在靶点,至少在人类白细胞抗原-A2(HLA-A2)受限的情况下是如此。然而,KIF20A在人脑胶质瘤中的表达情况,与细胞功能、肿瘤生物学行为的关系以及相应潜在的分子机制目前还没有报道过,本研究旨在探讨KIF20A在胶质瘤中的表达情况及与临床病理特征的联系;并研究KIF20A在胶质瘤细胞中对增殖、迁移、侵袭、凋亡以及细胞周期的影响;进而初步探讨相关的分子作用机制,为胶质瘤的基因靶向治疗提供新的理论依据和新方向。第一部分 KIF20A在人脑胶质瘤中的表达及与临床病理特征的联系目的检测KIF20A在人脑胶质瘤组织及正常脑组织中的表达情况,并联系患者的各项临床病理参数进行相关性分析,探讨KIF20A在胶质瘤组织中的表达情况。方法收集山东大学齐鲁医院人原发星形细胞瘤标本94例,10例正常脑组织标本来自聊城市第二人民医院去骨瓣减压术患者,所有标本均由两位病理学专家确诊。利用免疫组化技术(IHC)分别检测胶质瘤和正常脑组织中KIF20A的蛋白表达情况,结合临床病理学参数,进行相关性分析;并对患者进行随访,收集生存资料进行COX单因素及多因素生存分析;并利用Western blot技术检测四种胶质母细胞瘤细胞株中KIF20A蛋白的表达量,为后续的细胞功能实验筛选合适的细胞株。结果1.免疫组化结果表明KIF20A在恶性星型细胞瘤中是表达的。平滑肌组织为阴性对照。研究发现,在94例恶性星型细胞瘤病例中有65例KIF20A染色阳性,10例正常脑组织中只有1例染色阳性。2.KIF20A在胶质瘤中的表达与患者的年龄、性别、肿瘤的大小无关,但与胶质瘤WHO病理学分级显著相关,随着病理分级的增加KIF20A的染色强度和阳性率均增加。3.单变量生存分析和多变量分析表明KIF20A高表达和较差的总体生存期相关(P=0.022;危险率(HR)=1.925;95%置信区间(CI)=1.098-3.375)。绘制 Kaplan-Meier生存曲线,log-rank分析结果显示,说明KIF20A过表达与胶质瘤患者的预后显著相关。4.此外Western blot检测KIF20A在胶质母细胞瘤细胞中的表达情况,发现在U87和U251细胞中,KIF20A的蛋白表达比T98和LN229高得多。筛选出U251和U87细胞进行体外生物学行为实验。结论KIF20A在人脑胶质瘤中存在过表达;KIF20A在人脑胶质瘤中的表达强度和范围随着WHO病理分级的升高而增强,说明KIF20A与胶质瘤的恶性程度密切相关;生存分析表明KIF20A的高表达是胶质瘤患者总体生存期的一项独立预后因素。第二部分 KIF20A对人脑胶质瘤细胞株生物学行为的研究目的通过体外实验分析KIF20A对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭、凋亡的生物学行为,以及对细胞周期时相分布的影响。方法筛选U251和U87细胞进行体外生物学行为实验,通过转染siRNA,干扰KIF20A 的表达,利用 quantitative Real-time PCR 和 Western blot 检测干扰效果;在此基础上利用CCK8法检测两种细胞株生长活性的变化,并观察克隆形成的差异;采用Transwell实验检测胶质瘤细胞迁移和侵袭能力的变化;通过流式细胞仪检测胶质瘤细胞周期时相分布和对细胞凋亡的影响。结果1.RT-qPCR and western blot分析表明在U251和U87细胞中,与对照组相比,在mRNA和蛋白水平,siRNA KIF20A明显降低干扰组中KIF20A的表达。2.利用CCK8方法分析细胞生长活性,显示干扰组OD值低于对照组。此外,干扰U251和U87细胞中KIF20A的表达会减少克隆形成的数量。3.Transwell实验结果显示干扰KIF20A的表达能显著降低两种细胞的迁移和侵袭能力。4.流式细胞仪显示干扰KIF20A的表达后,在U251细胞中G0/G1期细胞百分比由48.74 ± 1.33%增加至60.26 ± 1.27%;U87细胞中G0/G1期细胞百分比由48.33 ± 0.70%增加至61.49 ± 3.55%。然而在U251细胞中S期细胞百分比由35.53 ± 1.85%下降至24.40 ± 0.41%;U87细胞中S期细胞百分比由38.08 ± 0.33%下降至 24.76 ± 2.16%。5.干扰KIF20A后,和对照组相比,U87和U251细胞的总凋亡率增加。结论体外干扰KIF20A的表达后抑制胶质母细胞瘤细胞的活性和增殖,诱导细胞周期阻滞在G0/G1期,促进胶质母细胞瘤细胞的凋亡并抑制其迁移、侵袭能力。第三部分 KIF20A促进人脑胶质瘤细胞增殖、凋亡的分子生物学机制目的通过研究KIF20A在胶质瘤组织和细胞的表达以及体外对胶质瘤细胞株的生物学行为的影响,探寻相关的分子生物学机制和细胞信号通路,以寻找胶质瘤治疗策略的新方向。方法western blot检测干扰KIF20A表达后,PI3K/AKT信号通路、NF-κB信号通路、p53信号通路相关蛋白水平变化,细胞周期调控蛋白、凋亡相关蛋白的表达变化,并进行统计学分析表达差异。结果1.干扰KIF20A在胶质瘤细胞中的表达,结果发现与对照组相比,NF-κB、P53蛋白的表达水平没有变化,但磷酸化AKT(pAKT)表达水平下降。2.敲低KIF20A的表达后可以降低c-Myc和CyclinD1细胞周期相关蛋白的表达。3.此外发现敲低KIF20A表达后可以显著减少凋亡相关蛋白BCL2在U251和U87细胞中的表达,而BAX的表达增加。结论干扰KIF20A的表达后,胶质瘤细胞生存能力降低,细胞增殖受抑制,这些作用可能是通过抑制PI3K/AKT信号传导通路实现的。KIF20A表达下降使细胞周期调控蛋白c-Myc和CyclinD1表达降低,从而促使胶质母细胞瘤细胞阻滞在G0/G1期。下调KIF20A通过抑制Akt活性并激活内源性凋亡通路,即调节BCL2/BAX的比例来诱导凋亡。