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玉米是世界上最重要的粮食作物之一。玉米果穗的穗行数是单穗籽粒产量的重要组成因子，对籽粒产量起着重要作用。玉米穗行数的形成主要受遗传调控。前人已鉴定到了大量的玉米穗行数相关的数量性状位点(quantitative trait loci, QTL)，然而，已克隆的QTL仍然十分有限。因此，鉴定并克隆控制穗行数变异的关键基因，将有助于阐明玉米产量形成的遗传基础和调控网络，发掘优良等位基因，也可为高产育种实践提供理论指导和基因资源。本研究利用图位克隆策略对一个玉米穗行数QTLqKRN5进行精细定位和候选基因克隆，通过核酸序列分析、表达分析、蛋白活性检测以及遗传转化等研究候选基因的遗传变异和生物学功能，主要结果如下：
1、近等基因系构建和QTL证实：利用初定位区间的两侧标记umc1365和umc2512，在NX531×SIL8的高代回交群体中筛选qKRN5区间的杂合单株，自交构建了纯合近等基因系qKRN5NX531和qKRN5SIL8。两个近等基因系间雌花序分生组织宽度差异显著(p=3.5×10-7)，果穗的穗行数、穗粒数和单穗籽粒产量差异显著，而主要植株形态性状和开花期无显著差异，表明该QTL区间控制玉米雌花序分生组织的大小及随后发育而成的穗行数和籽粒产量。
2、qKRN5的剖分：利用QTL区间内开发的12个多态性标记筛选近等基因系衍生的分离群体，鉴定到9个重组类型。通过子代测验将qKRN5剖分为两个紧密连锁的相引相QTL，其中qKRN5a的加性效应为0.34-0.39行，位于标记SC533和SC520之间，区间大小为884.5kb；qKRN5b的加性效应为0.93-0.94行，位于标记bnlg1879和umc2293之间，区间大小为1.07Mb。两个QTL间的物理距离为1.04Mb。
3、qKRN5b的精细定位和克隆：利用QTLqKRN5b区间内开发的4个多态性标记筛选分离群体，鉴定到5种重组类型，每种类型包含5-10个单株。在两年4个环境下鉴定纯合重组家系的表型，通过染色体片段代换作图将qKRN5b定位于标记SC36031和K13之间。该区段物理距离为32.05kb，编码一个基因，将其命名为KRN5b。在近等基因系间该基因编码区第794位存在1个SNP造成一个氨基酸变异，在基因非编码区和启动子区存在大量序列变异。
4、KRN5b的表达和蛋白功能鉴定：KRN5b主要在雌、雄穗等部位特异表达，在qKRN5NX531中的表达量为在qKRN5SIL8中的1.5倍。mRNA原位杂交显示，KRN5b主要在小穗维管组织、成对小穗分生组织(SPM)的起始部位、小穗分生组织和小花分生组织原基等处聚集，说明KRN5b为玉米穗部特异性表达基因。KRN5b酶活性测定显示，KRN5b的特异性底物为PI(4,5)P2和PI(3,4,5)P3，对PI(4,5)P2亲和性高；KRN5bNX531对PI(4,5)P2和PI(3,4,5)P3的水解活性显著高于KRN5bSIL8。
5、KRN5b的生物学功能：利用CRISPR创制了KRN5b功能缺失的2个突变体KO1和KO2。相较于野生型，突变体KO1和KO2的穗行数分别减少2.2行和1.6行(p=1.1×10-6，1.3×10-4)，雄穗分枝数分别减少2.4和3.0个(p=6.4×10-6，0.004)，雄穗的小花密度显著减少(p=0.021)。KO雌花序中的SPM缺陷，或无法发育、或仅分化产生一个SM，缺陷型SPM比例大于野生型(p=5.2×10-4)；雄穗小穗稀疏，且雄穗基部的分支减少。表明KRN5b通过控制成对小穗分生组织的起始和活性维持进而影响小穗的发育。
6、qKRN5b的育种潜力评估：将qKRN5NX531与5个优良自交系杂交，利用qKRN5b区间内开发的标记进行分子标记辅助选择，获得了以PH6WC、PH4CV、Sheng68、Sheng62为背景的BC4F1材料和以H21为背景的BC3F1材料，改良自交系的表现评估正在进行中。
1、近等基因系构建和QTL证实：利用初定位区间的两侧标记umc1365和umc2512，在NX531×SIL8的高代回交群体中筛选qKRN5区间的杂合单株，自交构建了纯合近等基因系qKRN5NX531和qKRN5SIL8。两个近等基因系间雌花序分生组织宽度差异显著(p=3.5×10-7)，果穗的穗行数、穗粒数和单穗籽粒产量差异显著，而主要植株形态性状和开花期无显著差异，表明该QTL区间控制玉米雌花序分生组织的大小及随后发育而成的穗行数和籽粒产量。
2、qKRN5的剖分：利用QTL区间内开发的12个多态性标记筛选近等基因系衍生的分离群体，鉴定到9个重组类型。通过子代测验将qKRN5剖分为两个紧密连锁的相引相QTL，其中qKRN5a的加性效应为0.34-0.39行，位于标记SC533和SC520之间，区间大小为884.5kb；qKRN5b的加性效应为0.93-0.94行，位于标记bnlg1879和umc2293之间，区间大小为1.07Mb。两个QTL间的物理距离为1.04Mb。
3、qKRN5b的精细定位和克隆：利用QTLqKRN5b区间内开发的4个多态性标记筛选分离群体，鉴定到5种重组类型，每种类型包含5-10个单株。在两年4个环境下鉴定纯合重组家系的表型，通过染色体片段代换作图将qKRN5b定位于标记SC36031和K13之间。该区段物理距离为32.05kb，编码一个基因，将其命名为KRN5b。在近等基因系间该基因编码区第794位存在1个SNP造成一个氨基酸变异，在基因非编码区和启动子区存在大量序列变异。
4、KRN5b的表达和蛋白功能鉴定：KRN5b主要在雌、雄穗等部位特异表达，在qKRN5NX531中的表达量为在qKRN5SIL8中的1.5倍。mRNA原位杂交显示，KRN5b主要在小穗维管组织、成对小穗分生组织(SPM)的起始部位、小穗分生组织和小花分生组织原基等处聚集，说明KRN5b为玉米穗部特异性表达基因。KRN5b酶活性测定显示，KRN5b的特异性底物为PI(4,5)P2和PI(3,4,5)P3，对PI(4,5)P2亲和性高；KRN5bNX531对PI(4,5)P2和PI(3,4,5)P3的水解活性显著高于KRN5bSIL8。
5、KRN5b的生物学功能：利用CRISPR创制了KRN5b功能缺失的2个突变体KO1和KO2。相较于野生型，突变体KO1和KO2的穗行数分别减少2.2行和1.6行(p=1.1×10-6，1.3×10-4)，雄穗分枝数分别减少2.4和3.0个(p=6.4×10-6，0.004)，雄穗的小花密度显著减少(p=0.021)。KO雌花序中的SPM缺陷，或无法发育、或仅分化产生一个SM，缺陷型SPM比例大于野生型(p=5.2×10-4)；雄穗小穗稀疏，且雄穗基部的分支减少。表明KRN5b通过控制成对小穗分生组织的起始和活性维持进而影响小穗的发育。
6、qKRN5b的育种潜力评估：将qKRN5NX531与5个优良自交系杂交，利用qKRN5b区间内开发的标记进行分子标记辅助选择，获得了以PH6WC、PH4CV、Sheng68、Sheng62为背景的BC4F1材料和以H21为背景的BC3F1材料，改良自交系的表现评估正在进行中。