转基因植物中非预期效应的产生有着复杂的遗传和环境因素,现有的检测方法主要依靠对已知的营养因子、抗营养因子和毒素等成分进行广泛的化学分析,但这些方法还存在着严重的不足,特别是在可能出现未知的毒素或抗营养因子,以及缺少有效的检测方法的情况下,这种方法具有很多局限性.为了研究非预期效应产生的机理和增加检测出非预期效应的可能性,需要采用各种不同的、更加有效的策略.为此,该文以蛋白质组学方法来研究拟南芥T-DNA插入突变体中蛋白质表达谱的变化,为蛋白质组学方法在非预期效应研究中的应用奠定基础.以模式植物拟南芥为材料,对采用T-DNA插入方法获得的拟南芥突变体进行TAIL-PCR,扩增出T-DNA的侧翼序列并测序,经过与拟南芥基因组数据库进行比对,确定T-DNA的插入位点.选择T-DNA插入位点分别位于基因间、内含子区、外显子区、基因上游和基因下游5种不同T-DNA插入位点类型的12个拟南芥突变体,在开花结束、衰老之前提取全蛋白进行差异蛋白质组学分析.对拟南芥突变体的差异蛋白质组学分析基于双向电泳,为获得其蛋白质组表达谱的全貌,采用了17cm pH3-10的IPG预制干胶条进行第一向等电聚焦,随后进行12.5﹪的SDS-PAGE.经考马斯亮兰R-250染色的双向电泳凝胶可以稳定地检测到400-500个蛋白质点.在双向电泳专业分析软件PDQuest Ver.7.2的辅助下,对拟南芥突变体的蛋白质组表达谱进行分析.分析结果显示,在拟南芥个体的蛋白质表达谱之间存在着较大的个体差异,说明在确定转基因植物自然变异的基线标准方面还需要做很多工作,这是进行各种分析的基础.在12个突变体中,共有102个表达量发生显著变化的蛋白质点经胰蛋白酶胶内酶解后进行MALDI-TOF分析,其中,59个点表达量上调,43个点表达量下调.共有66个蛋白质点通过数据库检索得到了鉴定,它们分别属于初级代谢,15.6﹪;能量传递,6.2﹪;细胞生长、分裂,3.2﹪;转录调控,4.7﹪;蛋白质合成与降解,6.3﹪;贮藏蛋白,4.7﹪;结构蛋白,6.3﹪;信号传递,9.4﹪;植物防御,17.2﹪;次生代谢,3.2﹪;功能未确定,23.4﹪,说明外源基因的插入和表达对植物的生命活动有着广泛的影响.但没有发现新蛋白,未发现植物生理、生化和代谢过程中发挥重要功能的蛋白质或致敏和毒素蛋白质.部分蛋白质点在拟南芥突变体中以较高的频率出现,如1号蛋白质点,在分属5种T-DNA插入位点类型的9种突变体中出现,可能预示着转基因植物中某种共有的变化机制及其在非预期效应检测中作为标志性分子的可能性.蛋白质组学技术是转基因植物中非预期效应的很有前景的一种研究方法,但在技术平台的优化、保证特异性、灵敏度和其结果有效性方面还需要进一步加强研究.此外,蛋白质组学方法的成功应用需要建立相应的数据库,其中应包含对应于转基因植物不同开发阶段和环境条件下的自然变异信息.