大肿瘤抑制子(Large tumor suppressor1,LATS1)是Hippo信号通路中的重要激酶,可通过直接磷酸化下游YAP/TAZ进而介导Hippo信号通路的激活,在维持细胞稳态中发挥重要作用。SUMO化修饰是一类动态的、可逆的、重要的类泛素蛋白质翻译后修饰途径,可通过影响蛋白质活性、稳定性、定位等最终影响细胞的功能。在本研究中,我们发现LATS1在K751位点的SUMO化修饰可抑制其激酶活性并通过影响Hippo信号通路最终抑制其肿瘤抑制功能。　　我们通过免疫共沉淀证明了内源或外源过表达小类泛素修饰子1(Small ubiquitin-like modifier,SUMO1)均能够与内源或外源LATS1结合,同时通过免疫荧光检测外源过表达的SUMO1和LATS1的共定位情况,我们发现SUMO1和LATS1在胞浆及胞核中共定位良好。通过体外SUMO化修饰反应检测到被SUMO1修饰的LATS1,证明SUMO1可直接修饰LATS1。通过突变SUMO1的底物结合位点G97或敲降SUMO化修饰过程中的必须E2酶抑制SUMO化修饰过程后,LATS1不再与SUMO1结合。进一步根据蛋白质发生SUMO化修饰的序列特点用软件预测出LATS1所有潜在的SUMO化修饰位点包括K49、K505、K622、K699、K751和K830。将这些潜在的修饰位点的赖氨酸分别突变成精氨酸后通过Taed4双荧光素酶报告基因检测筛选出K751和K830在维持Hippo信号通路的转录输出中均发挥重要作用,K751R突变可抑制Taed4的转录活性,而K830R突变则呈现相反的促进Taed4的转录的作用。通过免疫共沉淀的方法检测293T细胞中LATS1的K751R突变体和K830R突变体发生SUMO化修饰的数量,实验结果显示K751R突变减少LATS1的SUMO化修饰程度较K830R突变更为明显,证明K751是LATS1发生SUMO化修饰的主要位点。　　我们进一步研究了K751R突变后对Hippo信号通路的影响。首先通过蛋白免疫印迹检测了Hippo信号通路的核心分子的蛋白表达情况,实验结果表明K751R突变后促进了LATS1在T1079位点的磷酸化,促进下游YAP/TAZ的磷酸化进而减少了YAP/TAZ的蛋白总量。其次,通过蛋白质的核质分离实验和免疫荧光实验,证实K751R突变后抑制了YAP/TAZ的核转运。最后,通过Tead4(TEA domain transcription factors,Tead)荧光素酶报告基因实验证明K751R抑制了Tead4的转录活性,并通过荧光定量PCR实验检测了Hippo信号通路靶基因的表达情况,实验结果表明K751R突变后抑制了靶基因CTGF(Connective tissue growth factor,CTGF)和CYR61(Cysteine rich protein61,CYR61)的表达。　　我们还研究了LATS1的K751位点SUMO化修饰对Hippo信号通路的作用机制。通过免疫荧光检测LATS1的K751位点突变后对其蛋白定位的影响,实验结果表明LATS1的SUMO化修饰不影响LATS1的亚细胞定位。进一步通过免疫共沉淀实验证明了LATS1的K751R突变也不影响它与YAP和TAZ的结合。最后通过使用放线菌酮(Cycloheximide,CHX)抑制蛋白质的合成,观察K751R突变后对总LATS1和磷酸化LATS1蛋白降解的影响,蛋白免疫印迹结果证明K751R突变并不影响LATS1总蛋白的稳定性但是明显提高了磷酸化LATS1(Thr1079)的稳定性。　　此外,我们通过免疫共沉淀的方法比较了正常肝脏细胞L02和肝脏肿瘤细胞HepG2中LATS1的SUMO化修饰水平,实验结果表明在肝脏肿瘤细胞HepG2中LATS1的SUMO化修饰明显多于正常肝脏细胞L02,且在HepG2细胞中LATS1的SUMO化修饰主要发生在K751位点。最终通过对稳定过表达LATS1或K751突变体的HepG2细胞进行分析,证明了LATS1在K751位点的SUMO化修饰减弱了LATS1的激酶活性进而抑制了Hippo信号通路,最终不仅促进了细胞的增殖和克隆形成还抑制了细胞凋亡。　　最后,我们通过裸鼠皮下接种稳转LATS1或K751突变体的HepG2细胞构建了裸鼠移植瘤模型,定期测量瘤体体积,发现过表达K751R突变体的肿瘤的生长速度明显低于过表达野生型LATS1的肿瘤。我们进一步通过免疫荧光检测肿瘤组织细胞增殖标记蛋白ki67表达情况,结果证明K751R突变体过表达的肿瘤组织中ki76表达明显低于野生型LATS1过表达组,说明K751R突变抑制了肿瘤的增殖。此外,对各实验组肿瘤组织的TUNEL染色结果表明K751R突变促进了肿瘤的凋亡。　　总之,我们在体内外的研究结果均证明了LATS1在K751位点的SUMO化修饰抑制了其激酶活性以及肿瘤抑制功能。我们的研究为阐明Hippo信号通路的调控方式提供了新的视角,并提示LATS1的SUMO化修饰在肿瘤发展中可能具有重要作用。