研究背景和目的胃癌是来源于胃上皮恶性肿瘤,发病率居全球第四位。在我国,胃癌的发病率仍位居各种恶性肿瘤第二位,死亡率位居第三位。随着胃癌根治术及联合化疗方案的进步,胃癌的病死率呈逐渐下降趋势,但胃癌仍有较高的淋巴结转移及血管侵润,预后仍较差。深入研究胃癌的发病机制及侵袭转移机制,将有利于胃癌的预防和治疗。炎症和肿瘤关系密切,一方面,炎症通过炎性细胞及炎性因子参与杀伤肿瘤细胞,扮演先天性免疫系统的清道夫角色,另外一方面,炎症可通过诱发基因突变(如ROS/RNS),表观遗传学修饰,功能蛋白活性调节,参与癌症的发生及癌细胞的增殖、抗凋亡、浸润及转移(免疫逃避)。幽门螺杆菌是世界卫生组织公认的致癌原,其可诱导产生慢性萎缩性胃炎,进而引起不典型增生及胃癌,表明炎症是胃癌发生的启动因素及关键环节。作为调节炎性反应的细胞因子,其可能在肿瘤发生或进展中扮演重要的角色。IL-6是炎性反应及肿瘤微环境中最常见的细胞因子,其启动子区单核苷酸位点与消化道肿瘤(包括食管癌、肝癌、结肠癌等)易感性密切相关,且能促进多种癌细胞的增殖、浸润及转移,IL-6的中和抗体(tocilizumab)有望进入肿瘤靶向或辅助治疗的临床II期试验。IL11是IL6超家族成员之一,最初被发现存在于培养的纤维母细胞上清液中,该上清液能刺激IL6依赖性的浆细胞瘤生长及IgG生成,此后,IL11被发现存在许多生理功能,如刺激红细胞及血小板生成,抑制脂肪细胞的分化成熟、活化巨核细胞,调节T细胞活化极性,促进破骨细胞的成熟,促进骨质的吸收及破坏,保留组织细胞的“干细胞”活性等。近十年来的研究又发现,IL11在胃癌发生及进展中较IL6发挥更重要作用,1)通过基因敲入技术构建gp130757F/F小鼠,该转基因小鼠的gp130分子757位点的酪氨酸分子被苯丙氨酸代替,导致其与负向调控因子SOCS3无法结合,从而引起gp130-STAT3持续性激活,在3月龄的时候自然产生胃窦部异型增生及胃癌,且IL11在肿瘤组织中表达升高。转基因胃癌模型gp130757F/F小鼠与IL11RA-/-敲除小鼠杂交后,肿瘤生成可完全阻断,但与IL6-/-敲除小鼠杂交,肿瘤大小无明显变化,但局部浸润程度明显增加,提示IL11-IL11RA信号通路在胃癌发生中具有关键作用。2)近期的小鼠实验研究发现,IL11主要表达于感染了幽门螺杆菌的小鼠胃底粘膜层的壁细胞,给小鼠腹腔内注射外源性IL11后,可引起胃底壁细胞及主细胞的缺失,粘膜细胞增生、化生,同时伴有胃内PH值升高,壁细胞超微结构的改变及离子通道蛋白(与分泌胃酸密切相关)基因表达的改变,这些均提示IL11可以引起萎缩性胃炎,可能在胃癌的发生中发挥重要作用。3)体外细胞学实验发现,外源性IL11能增强胃癌细胞株的侵袭能力。然而,IL11在慢性非萎缩性胃炎及胃癌癌前病变(萎缩性胃炎、上皮内瘤变)中表达情况,胃癌组织中IL11及IL11RA的表达情况与胃癌患者总体生存率之间的关系,IL11促进胃癌细胞迁移及侵袭的分子机制及信号通路,IL11及IL11RA单核苷酸多态性与胃癌易感性之间的关系,目前均未有研究报道。为此,我们拟从人体组织学、细胞生物学及分子流行病学上来阐述上述问题。研究方法1.收集64例慢性非萎缩性胃炎、慢性萎缩性胃炎、低级别上皮内瘤变和高级别上皮内瘤变组织标本,采用免疫组化方法检测IL11、IL11RA在各种组织中表达情况,并结合幽门螺杆菌感染情况(14C-UBT检测或快速尿素酶实验)进行比较分析。2.收集167例手术切除的胃癌组织标本,采用免疫组化方法检测胃癌组织上IL11、IL11RA的表达情况,并与胃癌分化程度、淋巴结转移、局部浸润及总体生存时间进行分析比较。3.免疫印迹法检测正常胃粘膜细胞株及各种胃癌细胞株IL11RA的表达情况,筛选出稳定表达IL11RA的胃癌细胞株。4.采用CCK-8法检测IL11对胃癌细胞株MGC803和SGC7901增殖功能的影响。5.采用细胞划痕实验及Transwell细胞迁移实验了解IL11对MGC803和SGC7901迁移功能的影响。Transwell细胞迁移实验中下室内分别加入STAT3抑制剂S31-201或P13K抑制剂LY294002,了解其对IL11诱导的迁移功能影响。6.采用Transwell细胞侵袭实验了解IL11对胃癌细胞株MGC803侵袭功能的影响,下室内分别加入S31-201或LY294002,观察其对IL11诱导的侵袭功能的影响。7.免疫印迹法检测IL11刺激胃癌细胞株MGC803后各种通路蛋白STAT3, P-STAT3, ERK, P-ERK, AKT, P-AKT的表达情况。8.实时荧光定量PCR检测IL11刺激胃癌细胞株MGC803 1h,6h,24h时COX2, VEGF, HIF-la的表达情况。9.免疫印迹法检测IL11刺激胃癌细胞株MGC80312h,24h,36h,72h时ICAM-1, MMP2, MMP9, E-cadherin, Vimentin的表达情况。10.胃癌细胞株MGC803在无血清培养基及含IL11(100ng/ml)培养基中长期培养(5天),显微镜下观察并比较细胞生长方式、细胞形态的变化。11.免疫荧光检测IL11刺激胃癌细胞株MGC803后E-cadherin, Vimentin的表达情况。12.胃癌细胞株MGC803分别转染STAT3-siRNA, STAT3-siRNA sc, AKT-siRNA, AKT-siRNAsc,再行IL11刺激,免疫印迹法了解敲除STAT3及AKT是否影响IL11对E-cadherin及Vimentin的表达调控。13.收集108例中国南方人群胃癌患者及367例正常对照人群的血标本,进行DNA抽提,PCR扩增及基因测序分析(IL11 SNP位点：rs1126757和rs4252546；IL11RASNP位点：rs1061758和rs2812357),了解四个多态性位点等位基因频率在病例组和对照组间的分布。采用单因素和多因素logistic回归模型分析计算比值比(OR)及其相应的95%可信区间(CI),评估各个多态性位点与胃癌发病风险的关联强度。采用分层分析和多因素logistic回归控制混杂因素对分析结果的影响。14.统计学方法： 数据分析采用spss13.0统计学软件进行统计学处理。免疫组化计数资料均采用卡方检验,生存率分析采用Kaplan-Meier法,生存率比较应用log-rank检验。细胞增殖实验、细胞划痕实验、Transwell细胞迁移、细胞侵袭实验及荧光定量PCR实验计量资料若符合方差齐性,均采用方差分析法,组间两两比较采用LSD法,若方差非齐性,采用Dunnetts T3检验。P<0.05被认为有统计学意义。结果1. IL11在慢性非萎缩性胃炎及各种胃癌癌前病变组织(慢性萎缩性胃炎,低级别上皮内瘤变,高级别上皮内瘤变)上皮细胞的胞浆中表达,且各组之间的表达无明显差异(P=0.475)。IL11RA在慢性非萎缩性胃炎,慢浅萎缩性胃炎,低级别上皮内瘤变,高级别上皮内瘤变等各种胃粘膜上皮细胞的胞浆及胞膜中表达,且表达量呈逐渐增加趋势(P<0.05)。IL11RA在慢性非萎缩性胃炎及慢性萎缩性胃炎之间的表达无明显差异(P=0.073), IL11RA在低级别上皮内瘤变和高级别上皮内瘤变之间的表达无明显差异(P=0.075),但IL11RA在低级别上皮内瘤变和高级别上皮内瘤变中的表达量均高于慢性非萎缩性胃炎(P<0.01,P<0.01)和慢性浅表性胃炎(P<0.01)。2. 慢性胃炎及胃癌癌前病变组织中IL11表达与幽门螺杆菌感染密切相关,幽门螺杆菌阳性组IL11高表达比例达66.7%,较幽门螺杆菌阴性组(37.8%)增高,两组之间具有统计学差异(P=0.023)。IL11RA在幽门螺杆菌阳性组高表达IL11比例为59.3%,在幽门螺杆菌阴性组IL11高表达比例为35.1%,两组之间无统计学差异(P=0.056)。3.胃癌组织中IL11表达与胃癌分化程度无相关性(P=0.264),但与胃癌的浸润程度、淋巴结转移密切相关：IL11表达量越高,胃癌的浸润程度越深(P<0.05),淋巴结转移更多见(P<0.05)。IL11RA的表达与胃癌的分化程度、局部浸润及淋巴结转移均无相关性(P=0.860,P=0.870,P=0.416)。4. 胃癌组织中IL11的表达与胃癌的5年生存率相关： IL11低表达组,胃癌5年生存率为66%,IL11高表达组,胃癌5年生存率为28.2%,两者之间具有统计学差异(P<0.05)。胃癌组织中IL11RA的表达与胃癌的5年生存率无相关性：IL11RA低表达组,胃癌5年生存率为39.1%,IL11RA高表达组,胃癌5年生存率为47.5%,两者之间具无统计学差异(P=0.424)。5.正常胃粘膜细胞株GES无IL11RA表达。在胃癌细胞株中,MGC803细胞IL11RA表达量最高,其次为SGC7901细胞及AGS细胞,BGC823细胞不表达IL11RA。6.MGC803及SGC7901细胞分别用10%FBS,0% FBS(无血清培养基)及IL11 (100ng/ml)刺激24h,48h,72h及96h。0%FBS刺激组与IL11刺激组对MGC803细胞增殖功能影响无明显差别(P=0.77, P=0.096, P=0.849, P=0.115), 10%FBS刺激组对MGC803细胞增殖的影响明显高于0%FBS刺激组与IL11刺激组(P<0.05)。0%FBS刺激组与IL11刺激组对SGC7901细胞增殖功能影响无明显差别(P=0.295, P=0.058, P=0.083, P=0.727),10%FBS刺激组对SGC7901细胞增殖的影响明显高于0%FBS刺激组与IL11刺激组(P<0.05)。7.MGC803细胞及SGC7901细胞划痕实验中分别加用0%FBS,10%FBS及IL11刺激,实验开始时,细胞之间连接紧密,六孔板中间划痕上没有贴壁细胞,24h后,两种细胞均开始迁移,中间划痕距离开始缩小,48h后,MGC803细胞中10%FBS组和0%FBS+IL11组划痕大部分被细胞覆盖、修复,均明显高于0%FBS组(P=0.003, P=0.002); SGC7901细胞中10%FBS组和0%FBS+IL11组划痕大部分也被细胞覆盖、修复,均明显高于0%FBS组(P<0.01,P<0.01)。8.MGC803及SGC7901的Transwe11细胞迁移实验中,分别加用10%FBS, 10%FBS+IL11 (100ng/ml),10%FBS+IL11+S31-201和 (或)10%FBS+IL11+LY294002刺激。MGC803细胞在1O%FBS+IL11组穿透膜细胞数(297±15.1个/视野)较10%FBS组(166±11.0个/视野)明显增多,具有明显差异(P<0.05)；10%FBS+IL1+S31-201组(165±4.6个/视野)和10%FBS+IL11+LY294002组(178±8.4个/视野)穿透膜细胞数较10%FBS+IL11组明显减少(P<0.05)。SGC7901细胞在10%FBS+IL11组(336±23.0个/视野)穿透膜细胞数较10%FBS组(166±9.2个/视野)明显增多,具有明显差异(P<0.05);10%FBS+IL11+S31-201组(157±18.9个/视野)穿透膜细胞数较10%FBS+IL11组明显减少(P<0.05)。9.MGC803细胞的Transwell细胞侵袭实验中,10%FBS+IL11组(110±15.9个/视野)穿透膜细胞数较10%FBS组(41±4.6个/视野)明显增多,具有明显差异(P<0.05); 10%FBS+IL11+S31-201组(58±8.1个/视野)和10%FBS+IL11+LY294002组(60±11.1个/视野)穿透膜细胞数较10%FBS+IL11组明显减少(P<0.05)。10.IL11刺激MGC803细胞及SGC7901细胞后,STAT3迅速发生磷酸化生成P-STAT3,在5min时达到高峰,此后逐步递减,但在1h时仍较明显。在IL11刺激前30min加入STAT3抑制剂S31-201,能在STAT3磷酸化的高峰阶段(5min)抑制STAT3的磷酸化。IL11刺激MGC803细胞株前,ERK本身已经发生磷酸化,加入IL11刺激后,亦未能明显增加ERK的磷酸化。IL11刺激SGC7901细胞株前,ERK发生微弱的磷酸化,加入IL11刺激后,亦未能明显增加ERK的磷酸化。IL11刺激MGC803细胞,AKT发生磷酸化生成P-AKT,在30min时达到高峰,此后逐步递减,在1h时P-AKT含量很低,在IL11刺激前30min加入AKT抑制剂LY294002,能在AKT磷酸化的高峰阶段(30mmin)抑制AKT的磷酸化。IL11刺激SGC7901细胞株前,AKT未发生磷酸化,加入IL11刺激后,亦未能明显增加AKT的磷酸化。11.免疫印迹实验发现,IL11刺激MGC803细胞12h,24h,36h,72h时,未发现有ICAM-1,MMP2,MMP9表达的变化。实时荧光定量PCR实验发现,IL11刺激MGC803细胞1h,6h,24h时COX2, VEGF, HIF-1a的表达未见明显变化(P=0.975,P=0.108,P=0.886)。12.IL11长时间刺激(5天)MGC803细胞,发现细胞生长较为疏松,均匀,无成团聚集情况,部分细胞直径拉长,而0%FBS刺激组细胞呈团块状排列,团内细胞排列紧密,均匀。免疫印迹及免疫荧光均发现,IL11刺激MGC803细胞36小时后,E-cadherin表达下调,Vimentin表达上调。13.MGC803细胞先转染AKT-siRNA,阴性对照AKT-siRNA sc, STAT3-siRNA,阴性对照STAT3-siRNA sc后,再使用100ng/ml IL11刺激36h时,IL11+STAT3-siRNA及IL11+AKT-siRNA组对钙黏蛋白的表达无影响,IL11+AKT-siRNA组对波形蛋白的表达无影响,IL11+STAT3-siRNA组上调波形蛋白的表达较IL11+STAT3-siRNA sc组明显减低。14. rs1126757 A/G等位基因频率在胃癌组是GG (8.3%), AG (37%)和AA(54.6%),在对照组是GG (8.7%), AG (33%)和AA(58.3%),两组基因分别未见统计学差异(P=0.734)。rs4252546 A/G等位基因频率在胃癌组是AA(9.3%),AG(37.0%)和GG(53.7%),在对照组是AA (7.1%), AG (33.2%)和GG(59.7%),两组基因分别未见统计学差异(P=0.500)。rs1061758 A/G等位基因频率在胃癌组是AA (22.2%), AG (53.7%)和GG(24.1%),在对照组是AA (24.9%), AG (49.6%)和GG(25.5%),两组基因分别未见统计学差异(P=0.742)。rs2812357 C/T等位基因频率在胃癌组是CC (19.4%), CT(50.9%)和TT(29.6%),在对照组是CC(16.7%), CT(60.3%)和TT(23.0%),两组基因分别未见统计学差异(P=0.212)。运用单因素Logistic回归分析发现,rs1126757A/G显性模型OR=0.985,95%CI 0.454-2.139, rs4252546 A/G显性模型OR=1.330,95%CI 0.620-2.854, rs1061758 A/G显性模型OR=0.860,95%CI 0.516-1.435, rs2812357 C/T显性模型OR=1.232,95%CI 0.757-2.005。通过对年龄、性别、烟酒史等因素的调节,运用多因素Logistic回归分析也未能发现这四个SNP与胃癌有统计学关联。分层分析发现,与野生基因型相比,4个SNP位点中变异基因与胃癌发病风险的效应在年龄、吸烟、饮酒等不同亚组中未见显著性差异。rs1061758位点A→G突变在女性患者中可能为保护因素(OR=0.102,95%CI:0.012-0.895)。结论1. IL11RA可能在萎缩性胃炎-上皮内瘤变的胃癌发生过程中发挥重要作用。2. 幽门螺杆菌感染可能会上调慢性胃炎及癌前病变胃粘膜组织中IL11的表达,参与促进胃癌的发生。3. 胃癌组织中IL11的表达可作为判断患者预后的指标。4.IL11可通过STAT3信号通路及P13K信号通路参与促进胃癌细胞上皮-间质细胞转换,促进胃癌细胞的侵袭及迁移。5.IL11基因上SNP位点rs1126757和rs4252546与胃癌患者整体的易感性无相关性。IL11RA基因上SNP位点rs1061758和rs2812357与胃癌患者整体的易感性无相关性,但在女性患者中rs1061758位点A→G突变可能为保护因素。