研究背景及意义食管癌是世界常见消化道恶性肿瘤之一,其位于全球肿瘤发病率的第8位,死亡率的第6位,发病具有明显的地域性。我国是食管癌高发国家之一,食管癌的发病率及死亡率均居世界首位,每年死于食管癌的病人约有21万。食管癌的病理分型主要分为食管鳞癌及食管腺癌,其中食管鳞癌约占我国食管癌的90%。作为一种高度侵袭性恶性肿瘤,食管鳞癌易于发生转移,其转移方式主要为淋巴转移,而食管鳞癌的淋巴结转移同时也是影响患者预后的最重要因素。解剖学观点认为,由于食管的独特解剖特点,即在食管黏膜下层含有丰富的淋巴结管系统,因此食管鳞癌较易经此发生淋巴结转移。但随着对肿瘤研究的逐步深入,单纯的解剖学特点并不能完全解释食管鳞癌为何易于淋巴结转移。趋化作用是指细胞沿化学刺激因子浓度梯度的定向移动,其实现需要通过趋化因子与细胞表面的趋化因子受体结合,激活细胞内信号通路,调控下游基因表达而诱导细胞的定向迁移。趋化作用广泛的参与淋巴归巢及炎症反应等一系列生理活动。而近来的研究证实,趋化作用参与了肿瘤的靶器官定向转移过程：肿瘤细胞借助自身表面的趋化因子受体通过趋化作用定向转移至富集相应趋化因子的靶器官。CCR7作为趋化因子受体家族一员,主要表达于成熟淋巴细胞及树突状细胞,其相应的特异性配体CCL19/21广泛表达于次级淋巴系统,二者参与介导了淋巴细胞的归巢行为。目前研究发现CCR7异常表达于乳腺癌、前列腺癌、肺癌、食管鳞癌等多种肿瘤细胞,并且与肿瘤的淋巴结转移密切相关。以上提示了CCL19/21-CCR7在促进肿瘤淋巴结特异性转移方面可能发挥着重要作用。黏蛋白1(Mucin 1,MUC1)是一类相对高分子量的跨膜糖蛋白,其分子由核心肽与糖链组成,主要表达于上皮或内皮细胞,研究表明MUC1在上皮细胞更新分化、维持上皮完整性方面起着重要作用。MUC1作为一种异二聚体,包含MUC1-N和MUC1-C两个亚基,其中MUC1-N位于胞外,含有多段氨基酸重复序列,并伴有广泛的糖基化,其借助于MUC1-C跨膜亚基而附着于细胞。近来的研究发现MUC1在多种肿瘤中表达上调,参与肿瘤的发生发展过程,且多项基础研究证实MUC1作为一种原癌基因可以通过多种途径促进肿瘤细胞的恶性生物学行为。我们先前的研究工作证实CCR7及MUC1在食管鳞癌中均存在表达上调,并且与患者的淋巴结转移、复发及预后不良密切相关,提示CCR7及MUC1可能参与促进食管鳞癌淋巴结转移过程。尽管多项基础研究已经部分揭示了CCR7诱导肿瘤淋巴结转移的机制,但主要局限于CCR7本身的生物学作用及其所影响的下游信号通路；目前对CCR7所调控的在肿瘤侵袭性生物学行为中起关键作用的下游分子所知甚少,而MUC1在CCR7所介导的食管鳞癌淋巴结转移过程中的作用更是未见有相关报道。在本研究中,拟通过检测食管鳞癌组织中CCR7与MUC1的表达情况,分析二者在食管鳞癌中的相关性及其与淋巴结转移、区域淋巴结转移性复发及预后的关系；以此为基础体外验证MUC1在CCR7所诱导的食管鳞癌侵袭性生物学行为中的作用,从而判定MUC1是否为CCR7所诱导的食管鳞癌淋巴结转移过程中所调控的关键下游分子,并进一步探索其具体分子机制,以期为食管鳞癌的淋巴结转移分子机制提供新的补充,并为针对食管鳞癌淋巴结转移的靶向治疗提供理论基础。第一部分CCR7与MUC1在食管鳞癌中的表达及其临床病理意义目的：明确CCR7与MUC1在食管鳞癌组织中的表达情况,分析二者相关性及其临床病理意义。方法：对2006年1月～2009年1月间,山东大学附属省立医院胸外科经手术治疗的胸中段食管鳞癌临床资料完整的153例患者进行回顾性研究,所有患者均术前病理诊断为食管鳞癌,手术均完全切除肿瘤并进行胸腹二野淋巴结清扫,术后无严重并发症。通过免疫组化方法检测鳞癌组织标本中CCR7及MUC1的表达,染色结果根据染色面积及染色强度采用免疫积分法进行评判,结合临床资料,利用SPSS 19.0建立数据库。采用χ2检验判断CCR7/MUC1与临床病理特征的关系、Kaplan-meier法进行生存分析、Log-rank检验判断生存差异性、Spearman相关系数判定CCR7与MUC1在食管鳞癌组织中的相关性。结果：在153例食管鳞癌患者病理组织中,88例判定为CCR7表达阳性,97例判定为MUC1表达阳性,CCR7与MUC1的表达均与食管鳞癌患者的淋巴结转移呈正相关(P<0.01,<0.001)。而与年龄、性别、肿瘤大小、分化、浸润深度等无明显关系。生存分析显示CCR7与MUC1的表达均与患者术后3年内复发(P<0.01,P<0.001)及预后不良(P<0.01,P<0.01)相关。Spearman分析显示CCR7与MUC1在食管鳞癌组织中的表达呈正相关(P<0.001)。结论：CCR7与MUC1在食管鳞癌中的表达与患者的淋巴结转移,术后复发及预后不良相关,提示CCR7与MUC1参与了食管鳞癌的淋巴结转移过程。第二部分CCL21/CCR7诱导食管鳞癌细胞MUC1表达上调及机制探索目的：探索CCL21/CCR7在体外对食管鳞癌细胞MUC1表达的影响及具体分子机制。方法：应用qRT-PCR、Western-blot及免疫荧光染色方法观察CCL21/CCR7对食管鳞癌细胞株Eca9706、KYSE150、KYSE410及KYSE450中MUC1表达水平的影响。Western-blot技术检测CCL21/CCR7对食管鳞癌细胞株Eca9706及KYSE410中ERK及AKT信号通路激活水平及应用相应抑制剂后对MUC1表达水平的影响。Western-blot及免疫荧光染色方法检测CCL21/CCR7对食管鳞癌细胞株Eca9706及KYSE410中Spl磷酸化水平的影响。双荧光报告基因系统检测CCL21/CCR7对MUC1基因启动子活性的影响。染色质免疫共沉淀技术(ChIP)检测CCL21/CCR7对Spl与MUC1启动子的结合情况的影响。结果：qRT-PCR及Western-blot结果显示在4株细胞系中CCR7与MUC1的表达有相关性：KYSE150中CCR7及MUC1的表达水平最低,而KYSE410及Eca9706中CCR7及MUC1的表达水平均较高。qRT-PCR结果显示CCL21刺激后,CCR7表达水平较高的KYSE410、KYSE450及Eca9706中MUC1 mRNA表达水平均明显上调,而在CCR7表达水平最低的KYSE150中则无明显变化。qRT-PCR及Western-blot进一步证明CCL21诱导Eca9706及KYSE410中MUC1的表达上调具有时间及浓度依赖性。Western-blot结果显示CCL21/CCR7能够激活Eca9706及KYSE410中ERK及AKT信号通路,而Western-blot及ChIP实验显示特异性抑制ERK信号通路能够明显抑制MUC1启动子活性及MUC1的表达上调,而抑制AKT信号通路则对MUC1基因启动子活性及MUC1表达水平无明显影响。Western-blot及ChIP结果显示CCL21/CCR7能够通过ERK磷酸化Spl进而促进Spl与MUC1启动子的结合。结论：CCL21/CCR7在食管鳞癌细胞中能够通过ERK-Sp1轴上调MUC1的表达。第三部分MUC1在CCL21/CCR7诱导食管鳞癌细胞侵袭性生物学行为中的作用目的：探索MUC1在CCL21/CCR7所诱导食管鳞癌细胞体外侵袭迁移中的作用。方法：通过Transwell小室实验检测CCL21/CCR7对食管鳞癌细胞体外侵袭迁移的影响。通过构建靶向沉默MUC1 siRNA及CCR7 cDNA lentivirus载体,转染食管鳞癌细胞获得MUC 1沉默KYSE410、Eca9706及CCR7过表达KYSE150细胞系,qRT-PCR及Western-blot技术检测MUC1基因沉默及CCR7基因过表达效果。结果：Transwell小室实验证实相对于对照组,在下层小室中加入CCL21可以诱导食管鳞癌细胞KYSE410及Eca9706的迁移；同时Transwell小室侵袭实验证实CCL21刺激后相对于对照组能够明显增强食管鳞癌细胞KYSE410及Eca9706的侵袭能力。而采用特异性抗体封闭CCR7受体后可以明显抑制CCL21诱导KYSE410及Eca9706的体外侵袭及迁移能力。沉默MUC1基因后能够明显抑制CCL21诱导KYSE410及Eca9706的侵袭及迁移能力；而过表达CCR7后能够明增强CCL21诱导KYSE150的体外侵袭及迁移能力,并能上调MUC1基因表达。结论：CCL21/CCR7能够通过上调MUC1的表达而增强食管鳞癌细胞体外迁移及侵袭能力。