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甘薯是重要的粮食、饲料、工业原料作物,也是粮食安全的底线作物。甘薯的块根及茎叶营养价值高,已成为公认的健康食品。甘薯根系发达,茎蔓有着地生根的习性,吸水吸肥能力强,对土壤和日照长度要求不严格,适应性广,在世界各地均有种植。目前全世界甘薯栽培面积达1.2亿亩,总产1亿吨。作为世界第七大粮食作物,广泛种植于世界上100多个国家,以亚洲种植面积最大,非洲排在第二位。中国甘薯栽培面积5千万亩,总产7千多万吨,分别占世界的42%和68%。自从16世纪传入中国之后,甘薯便在福建和广东一带栽培并传播到长江流域和黄河流域,形成了多个栽培区域。在非洲甘薯是继玉米、水稻、小麦和木薯之后第五大粮食作物。随着世界经济的发展,甘薯在各国的消费形式也呈现多样化,美国等发达国家对甘薯的利用主要表现在防癌保健食品开发和做为优质蔬菜食用,发展中国家作为粮食的利用没有衰退,主要进行淀粉加工、优质鲜薯食用、菜用市场开发、保健食品开发等。一些非洲国家将甘薯作为食物,甚至作为食物能量的主要来源。从紫色甘薯中提取花青素,用于食品加工和保健食品的制作也有着非常广阔的前景。但是甘薯在生产上面临着许多病虫害的威胁,其中甘薯蔓割病(枯萎病)是重要的病害,在世界范围内均有发生,在中国南方甘薯生产区的危害尤其严重,阻碍了中国南方甘薯生产的发展。随着频繁的种质交流和品种的大面积推广,甘薯蔓割病危害有日益扩大的趋势。甘薯蔓割病由尖孢镰刀菌甘薯专化型(Fusarium oxysporum f.sp.batatas,Fob)侵染引起,目前,国内的生理小种有强致病菌Fb01、弱致病菌Fb02,美国甘薯产区也存在两个生理小种,已发现其中Race1对典型的抗病品种“Beauregard”致病,表明蔓割病菌具有不断进化,产生新的强致病生理小种的能力。这主要是因为病原尖孢镰刀菌与甘薯寄主存在竞争与协同进化,病菌可能形成新的生理小种,导致寄主抗性消失选育与应用抗病品种是病害防治最经济、最有效的方法,了解病原菌与甘薯的互作及其互作的分子机制,对于指导抗病育种,有效防控甘薯蔓割病,保障甘甘薯生产安全具有重要意义。但甘薯是同源异源六倍体,遗传背景复杂,关于甘薯的遗传研究水平有限。为了深入研究甘薯抗蔓割病机理,挖掘抗病相关基因,我们采用高通量测序技术,分析了不同抗病性的甘薯品种在蔓割病菌侵染时的基因转录表达特征,并挖掘了一批与甘薯防御蔓割病相关的基因。本研究以高抗和高感蔓割病甘薯品种金山57(JS75,蔓割病抗性鉴定的抗病对照品种)和新种花(XZH,蔓割病抗性鉴定的感病对照品种)为材料,分别用本实验室分离保存的强制病性蔓割病菌种Fob7(F07)和非致病性菌种Fob-04(F04)侵染甘薯茎蔓,组成五个不同的处理,即:JS57-F07,JS57-F04,JS57-CK,XZH-F07,XZH-CK。侵染后取茎段部位,分别提取各样品的总RNA,利用高通量测序平台进行转录组测序。结果表明,测序产生了 91366006个平均长度为100bp的片段,GC含量为45.10%。去除接头、引物序列、poly-A尾及质量不高的序列后,共有89944188个clean reads生成,组装成101988个平均长度为666bp的unigene,长度在201bp-15576bp范围内,超过36.6%的基因长度大于501bp。经过在蛋白质数据库BLAST比对,发现其中有62,605个基因(占61.38%)至少在NR,NT,K0,SwissProt,PFAM,GO and K0G中的一个数据库中与已知功能蛋白匹配,有8,683个基因(占8.51%)在上述所有数据库中均有注释。根据在Nr蛋白数据库BLAST比对和聚类分析结果,发现有40,918个基因(占40.1%)在G0中被聚类到46个类别中,其中三个最主要的类别分别是分子功能、细胞生物学功能,代谢功能。有22,613个基因在KOG中被聚类到26个类别中,最大的两类分别是“仅普通功能”和“翻译后修饰等”,另个,我们发现有122个基因被聚类到“防御机制”类别中。有19,578个基因与276个KEGG信号通路有关,最大的三个信号通路分别是翻译、信号转导和C代谢。我们比较了五个样品的基因表达谱,发现在蔓割病菌侵染后,甘薯中有大量的基因被上调或下调表达,上调表达的基因多于下调表达。在抗病品种金山57中,经强致病菌Fo-07侵染后,有6454个基因表达发生了改变,其中3843个基因上调表达,2611个基因下调表达。金山57经非致病菌Fo-04侵染后,基因表达变化趋势与经致病菌Fo-07侵染的结果大致相同,两者比较,经强致病菌Fo047侵染,上调表达的基因多了 561个,而下调表达的仅多38个。在感病品种新种花中,经致病菌Fo-47侵染后,有5552个基因上调表达,1274个基因下调表达。为了确定转录组测序数据结果的准确性,选择了 5个基因c47391g1,c51550g2,c52297g1,c54420g2 和 c56184g1 进行 qRT-PCR 检测,结果与 DGE 表达趋势相同,证明了测序结果准确可靠,可用于相关的研究,挖掘甘薯抗病相关基因。甘薯与蔓割病菌存在复杂的互作,符合基因对基因假说。植物在防御病害过程中,存在两层防御系统,即PTI和ETI。植物的RPPS蛋白,可识别病原菌的PAMPs,并将信号转导,引发下游防御相关基因表达,产生PTI抗病反应。病菌则可能产生效应蛋白,抑制植物抗病反应。植物的抗病R基因可识别病菌的效应蛋白,并诱发ETI,抵抗病菌侵染。在本研究中,我们发现了一系列与抗病相关的基因,以及其在不同品种中的表达模式,主要包括:(1)CERK1基因 CERK1蛋白可识别病原真菌的几丁质,并引发植物PTI抗病反应。我们在甘薯转录组中鉴定到5个CERK1基因,其中1个基因c60044_g1(编码CERK1 1蛋白)在抗病和感病品种中在受病害侵染后均上调表达,另1个基因c62516_g1(编码类CERK1蛋白)在抗病品种金山57受病害侵染后(JS57-F07,下同)下调表达。(2)MAPK基因 促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)链是真核生物信号传递网络中的重要途径之一,在基因表达调控和细胞质功能活动中发挥关键作用。我们鉴定了 66个MAPK信号转导相关基因,有6个差异表达,其中4个基因c51382_g1(编码受伤诱导 MAPK)、c54598_g1(编码 MAPK 20 异构体X2)、c58290_g1(编码MAPK)和c58750_g5(编码MAPK 9)在感病品种新种花受病害侵染后(XZH-F07,下同)上调表达,c58750_g5在抗病品种KS57-F07中也上调表达,而另外两个基因c65078_g2(编码MAPK 6异构体X1)、c66053_g1(编码受体蛋白激酶)在JS57-F07中下调表达。(3)信号转导相关基因 小分子激素包括JA、SA、ET三种激素是信号转导重要的成分。我们鉴定到了 14个JA信号相关基因,有2个差异表达,其中c43470_g1编码茉莉酸2,在JS57-F07中上调表达,c52478_g1编码茉莉酸甲基转移酶,在XZH-F07中下调表达。鉴定到了 25个SA相关基因,其中4个差异表达,c56489_g2和c57992_g1分别编码水杨酸结合蛋白2及其类似物,在JS57-F07中下调表达,c58625_g1编码UDP-糖基转移酶,在XZH-F07中下调表达,而c65549_g1也是编码UDP-糖基转移酶,在JS57-F07中上调表达,同时在XZH-F07中下高表达。鉴定到了 40个ET相关基因,其中14个差异表达,分别编码乙烯响应结合蛋白、各种乙烯响应因子、响应乙烯的转录因子等,其中有5个(c33996_g1、c55705_g1、c58358_g1、c58425_g1、c65518_g1)仅在 JS57-F07中上调表达,5 个(c45744_g1、c51416_g2、c52634_g1、c52634_g1、c64410_g1、)在仅在 XZH-F07中上调表达,3 个(c53488_g1、c57791_g1、c65518_g1)同时在 JS57-F07 和 XZH-/F07 中表达,1 个(c61066_g1)在 XZH-F07中下调表达。(4)转录因子基因 转录因子基因在植物抗病中起着调控基因表达的重要作用。WRKY转录因子是存在植物中的转录因子超家族,在植物抗病、抗虫、抗逆中起着重要的调控功能。我们在转录组中鉴定到了 123个WRKY基因,有8个差异表达,其中1个基因c33599_g2(编码WRKY结合蛋白)在JS57-F07中上调表达,1个基因c50623 g1(编码WRKY48类蛋白)在JS57-F07中下调表达,4个基因c54420 g2(编码 WRKY61)、c56135 g1(编码 WRKY75)、c60589_g1(编码WRKY71)、c64728_g1(编码 WRKY6)在 XZH-F07中下调表达,1 个基因 c46250_g1(编码WRKY56)在XZH-F07中下调表达,1个基因c57247_g1(编码WRKY22)同时在JS57-F07和XZH-F07中上调表达。NAC转录因子也是存在植物中的一类转录因子大家族,在植物免疫功能、基础防御、SAR中具有重要功能。我们鉴定到了 20个NAC基因,其中2个差异表达,c51550_g2(编码 NAC29)在XZH-F07中上调表达,c52292_g3(编码 NAC7 类蛋白)在JS57-F07中下调表达。MYB类转录因子家族是指含有MYB结构域的一类转录因子,在应答环境胁迫以和抵抗病菌的侵染中起到重要作用。我们鉴定了 22个MYB基因,发现其中1个c5221_g1基因(编码甘薯IbMYB1-2b蛋白)在JS57-F07中大幅上调表达。(5)PR蛋白 植物病程相关蛋白(PR)在受病菌及其它胁迫中诱导产生,具有防御、抗病、适应环境胁迫等多种功能。我们在转录组中鉴定到57个PR蛋白,有7个差异表达,其中3个基因c40413_g1(编码PR 4型蛋白)、c42566_g1(编码PR-4蛋白)、c58341_g1(编码PR-1型蛋白)仅在JS57-F07中上调表达,两个基因c47344_g1(编码PR-4A-类异构体1蛋白)、c54564_g1(编码PR-1蛋白)在JS57-F07中下调表达,1个基因c55964_g1(编码PR-10蛋白)同时在JS57-F07和XZH-F07中上调表达。(6)R蛋白 R蛋白是植物抗病反应的重要角色,可特异识别病原菌的效应蛋白并引发植物抗病反应。我们鉴定出了 94个R蛋白,有3个差异表达,其中有1个基因c56584_g1编码NBS-LRR型抗病基因,在JS57-F07中大幅度上调表达,推测在抗病反应中具有重要功能,1个基因c66373_g2编码抗晚疫病同源蛋白,在JS57-F07中下调表达,1个基因c56383_g1编码抗病类蛋白,在XZH-F07中上调表达