干细胞包括胚胎千细胞(embryonic stem cells，ESCs)和成体T细胞，这类细胞可以在体外培养和快速增殖，同时具有向自我更新和多向分化潜能，是目前多种疾病实验研究和临床治疗的热点。干细胞移植后能够分泌治疗性物质，并可能修复和替代损伤性疾病中受损的神经组织。因此，干细胞移植为脊髓损伤等中枢神经系统损伤性疾病带来了希望。骨髓间质千细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是成体干细胞的一种，获取简单，扩增容易，可在体外和体内向神经元样细胞分化，受到研究者更多的重视。 脊髓损伤(spinal cord injures，SCI)是临床常见疾病，给患者带来了极大痛苦，严重影响患者的生存质量。脊髓损伤的药物治疗受限于有限的药物种类和狭窄的治疗时间窗，康复治疗的效果也不能令人满意。目前，研究者更多将目光转向干细胞移植治疗脊髓损伤，MSCs自然受到研究者的青睐。本室对MSCs单独或结合神经营养因子及嗅鞘细胞治疗脊髓损伤的疗效和机制进行探讨，肯定了MSCs治疗脊髓损伤的有效性。 然而，MSCs治疗脊髓损伤的实验研究和临床应用也遇到和其他细胞移植同样的问题：首先是用来区分宿主细胞与移植细胞的传统标记和识别方法只能在离体情况下进行，显然，这些方法用于大动物实验或者临床研究时不可行。所以有必要寻找能够在体示踪检测和追踪移植细胞命运的方法。将需要移植的细胞进行磁性对比剂标记，通过磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)技术对其进行可视化追踪，就能得知移植细胞在体内的运动信息以及未来命运。钆-二亚甲基三胺五乙酸-叶酸(Gadolinium diethylenetriaminepentaacetic acid，Gd-DTPA)是一种T1造影剂，和铁剂类T2造影剂一样可用于细胞标记。Gd-DTPA相比其他造影剂用于细胞标记的优点在于其较少受到血流和周围其他正常和非正常组织结构信号的影响。那么，能否用Gd-DTPA标记MSCs来进行MSCs的在体MRI示踪?这是本课题要探讨的一个重要内容。另外一个问题是成年个体中枢神经系统(central nervous system，CNS)，尤其是损伤的CNS很可能不利于移植细胞的存活。即使是在细胞最好的状态下进行移植，据报道最多能有10﹪的移植细胞存活，而能够分化成为成熟神经元的移植细胞则更少。虽然在脊髓损伤的实验研究中，很多研究者建议细胞移植时间窗应选在损伤后7-10天，但有证据表明存活细胞数量仍不乐观。大部分细胞治疗用于打击性或压迫性脊髓损伤是采用髓内注射的方式，而注射器的刺入很可能对受损脊髓造成又一次大的损害。脊髓损伤后的微环境和随后注射造成的损害中，肿瘤坏死因子-α(tIJmor necrosis factor-α，TNF-α)等炎症因子及其引起的一系列炎症反应是一种重要因素。丹酚酸B盐(Salvianolic acid B，SalB)是我国传统中药丹参(salvia miltiorrhiza，Danst]en)的水溶性有效成分，已有研究证明Sal B具有很强的抗氧化作用和明显的抗炎作用。还有研究表明，复方丹参注射液可以用于治疗脊髓损伤。那么，应用Sal B能否促进移植的MSCs的存活呢?这是本课题要研究的又一重要内容。 综上所述，本研究拟采用带有红色荧光的阳离子转染试剂jetPEI-FluoR负载的Gd标记MSC(Gd-MSCs)，观察Gd标记对MSCs存活和增殖能力的影响，电镜检测Gd在MSCs内的分布情况，并对移植到大鼠脊髓损伤节段的Gd-MSCs进行MRI活体示踪；观察Sal B的神经保护作用以及是否在体外保护MSCs不受TNF-α的损伤，观察Sal B是否能促进移植到受损脊髓的MSCs的存活及两者联合应用后脊髓损伤大鼠的运动功能恢复情况。 本实验的研究内容由以下两部分组成： 第1部分：骨髓间质干细胞的磁性标记示踪 目的：观察Gd-DTPA成功标记MSCs后对其生物学特性的影响，观察MSCs中Gd-DTPA的分布情况，MRI示踪植入到脊髓损伤大鼠体内的MSCs，探讨Gd-DTPA标记MSCs的方法用于脊髓损伤研究的可行性。 方法：接种培养大鼠MSCs，用阳离子转染试剂jetPEI-FluoR结合Gd-DTPA标记MSCs。透射电镜观察Gd-DTPA在MSCs胞膜和胞浆的分布情况，MRI观察标记后MSCs的信号强度变化。用台盼蓝染色、MTT比色法和Hochest 33342染色法检测Gd-DTPA标记对MSCs的存活、增殖及凋亡的影响。移植标记的MSCs到脊髓损伤大鼠受损脊髓节段内，然后用MRI观察MSCs的分布和迁移情况，并用组织学方法验证。同时BBB评分评价标记的MSCs对脊髓损伤大鼠的功能恢复情况。 结果： 1．Gd-DTPA能够成功标记MSCs，且标记效率不低于80﹪。Gd-DTPA标记的MSCs在1.5T核磁共振扫描图像上清晰可见，标记的MSCs在T1加权图像上的信号强度明显增强。透射电镜证实Gd-DTPA存在于MSCs内。 2．Gd-DTPA标记不影响细胞存活、增殖和凋亡。 3．标记的MSCs在细胞移植后14天仍能够检测到信号强度的明显变化。标记细胞相对周围脊髓组织的信号强度增高在第1，3，7，14天分别为26.61﹪，22.81﹪。19.88﹪，14.42﹪。但是，到了移植后第21天，信号强度增高只有8.77﹪。MRI上，标记MSCs从注射处向损伤区迁移，并且在移植后第14天和第21天，没有发现细胞在损伤区以外区域出现，组织学结果也证实这一点。 4．标记MSCs和未标记MSCs移植的脊髓损伤大鼠的BBB评分从移植第7天开始比对照组的大鼠的评分高(P(0.05)，而两者之间则没有显著差异(P>0.05)。 结论：Gd-DTPA可有效标记MSCs；MRI可在体示踪移植到大鼠脊髓损伤节段的Gd-DTPA-MSCs，标记细胞集中分布在损伤区域。Gd-DTPA-MSCs的MRI示踪可能是阐明MSCs治疗脊髓损伤和其他中枢神经系统疾病作用机制的重要示踪方法。 第2部分：丹酚酸B盐协同间质干细胞修复大鼠脊髓损伤 目的：观察Sal B对脊髓损伤的神经保护作用，观察Sal B是否保护MSCs不受TNF-α的损害，以及是否能促进移植的MSCs在损伤脊髓的存活数量，探讨联合应用Sal B和MSCs治疗大鼠脊髓损伤的可行性。 方法：体外培养大鼠MSCs，观察Sal B对MSCs在TNF-α存在条件下的存活的影响。空洞面积分析和BBB评分观察Sal B对大鼠脊髓损伤的神经保护作用。大鼠脊髓损伤后第7天，移植5-溴脱氧尿核苷(5-bromodeoxyuridine，BrdU)标记的MSCs，并腹腔注射Sal B。采用BBB评分评价大鼠的运动功能恢复情况：细胞注射后7天和28天进行灌注取材，免疫组织化学染色观察移植的MSCs的存活情况，观察Sal B促进移植的MSCs存活的作用。 结果： 1．分别用TNF-α或TNF-α联合丹SalB处理MSCs，观察其对MSCs存活的影响。10ng/ml TNF-α作用24小时后MSCs大部分边缘翘起，呈半漂浮状；而100ng/mlSalB存在时，TNF-α对MSCs几乎没有影响。 2．SalB可以显著减小损伤大鼠脊髓的空洞面积(P<0.05)，从脊髓损伤后第14天起，SalB和PBS对照治疗组之间的BBB评分有显著差异(P<0.05)。 3．MSCs和SalB联合应用组的大鼠损伤部位有很多存活的MSCs聚集，而单纯MSCs组的细胞存活则比较少。存活细胞计数分析结果表明在移植后的第7天和28天，联合应用组的MSCs存活数量都比单独MSCs应用组要多(P<0.5)。联合应用组大鼠的运动功能恢复要比单纯MSCs恢复的要好(P<0.5)。 结论：SalB可以减少脊髓损伤空洞形成。SalB在体外保护MSCs免受TNF-α的毒性作用，在体内促进移植的MSCs的存活；联合应用MSCs和SalB能更好地促进脊髓损伤大鼠的功能恢复。 总结 通过以上实验研究，可得到以下结果： 1．Gd—DTPA能有效标记MSCs并且不影响MSCs的牛物学特性； 2．Gd—DTPA标记的MSCs在移植后14天内可用MRI活体示踪； 3．Gd—DTPA标记的MSCs迁移并分布在大鼠脊髓损伤部位； 4．Sal B可以在体外保护MSCs免受TNF—α的毒性作用； 5．Sal B提高MSCs的移植存活数量，两者联合应用明显促进大鼠脊髓损伤的功能恢复。