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[目 的]研究HOTAIR通过miR-152-3p调控HLA-G的表达,检测HOTAIR、miR-152-3p及HLA-G过表达及抑制后滋养细胞功能的变化,并探讨与胎盘功能相关的下游通路。研究HOTAIR和miR-152-3p调控HLA-G影响胎盘功能信号通路导致子痫前期发生的机制,为开发预防子痫前期的药物和制定治疗方案提供依据。[方 法]1.胎盘组织RNA-seq测序分析、生物信息学分析、双荧光素酶报告基因实验、获得性或丢失功能实验,研究HOTAIR、miR-152-3p及HLA-G的相互调控关系和机制。2.构建HOTAIR高表达及抑制慢病毒载体并转染HTR-8/Svneo细胞后采用qRT-PCR 实验检测 HOTAIR、miR-152-3p 和 HLA-G 表达水平,Western Blot(WB)实验、免疫荧光实验、ELISA实验检测HLA-G蛋白表达情况。并通过CCK8、EDU、细胞周期实验、凋亡染色、Transwell实验等检测滋养细胞增殖、迁移、侵袭功能变化,WB实验检测EMT相关蛋白变化。3.滋养细胞转染 miR-152-3p mimics、miR-152-3p inhibitor 后 qRT-PCR 实验检测HLA-G表达情况,Transwell实验检测滋养细胞迁移、侵袭功能变化,并通过WB实验检测HLA-G及EMT相关蛋白表达情况。4.滋养细胞共转染HOTAIR高表达及抑制慢病毒和miR-152-3p mimics、miR-152-3p inhibitor后通过Transwell实验检测滋养细胞迁移、侵袭功能变化,WB实验检测HLA-G及EMT相关蛋白表达情况。5.滋养细胞中过表达及抑制HLA-G后采用qRT-PCR实验检测HLA-G表达情况,WB实验检测HLA-G及EMT相关蛋白表达情况。Transwell实验检测细胞迁移、侵袭功能变化,并通过NK细胞毒性实验检测NK细胞对转染过表达及抑制HLA-G载体后的滋养细胞的细胞毒性反应。[结 果]1.RNA-seq测序结果表明重度子痫前期患者与正常产妇胎盘组织存在差异表达的lncRNA 6059个,差异miRNA 931个,差异mRNA 9798个,HLA-G在子痫前期胎盘中表达下调。对差异lncRNA、miRNA候选靶基因及mRNA的KEGG富集分析显示与T细胞受体信号通路、细胞粘附分子、凋亡、B细胞受体信号通路、炎症介质调节的TRP通道、Ras信号通路、TGF-β信号通路、同种异体移植排斥、移植物抗宿主病、自身免疫甲状腺疾病、类风湿性关节炎、抗原处理和呈递、细胞因子与细胞因子受体等通路相关。2.双荧光素酶实验结果表明转染miR-152-3pmimics后的HOTAIR及HLA-G野生型荧光素酶活性显著降低(P<0.05),而对突变型HOTAIR和HLA-G载体的荧光素酶表达活性无明显抑制作用(P>0.05)。3.qRT-PCR结果表明HOTAIR高表达后miR-152-3p表达水平降低,而HLA-G表达水平升高,HOTAIR表达抑制后则结果相反。转染miR-152-3p mimics后HLA-G表达水平降低,转染miR-152-3p inhibitor后HLA-G表达水平升高。4.WB结果表明HOTAIR高表达后HLA-G表达水平升高,HOTAIR抑制表达后结果相反。转染miR-152-3pmimics后HLA-G表达水平降低,转染miR-152-3p inhibitor后HLA-G表达水平升高。5.免疫荧光实验结果表明HOTAIR高表达后HTR-8/Svneo细胞胞浆(可溶型)及细胞膜表面(膜结合型)HLA-G荧光信号增强,HOTAIR表达抑制后HLA-G荧光信号减弱。6.ELISA实验结果表明HOTAIR高表达组细胞上清中HLA-G表达水平升高,HOTAIR抑制表达后结果相反;转染miR-152-3pmimics后细胞上清中HLA-G表达水平降低,转染miR-152-3p inhibitor后细胞上清中HLA-G表达水平升高,共转染后可部分逆转。7.通过CCK8、EDU、细胞周期实验、凋亡染色检测HTR-8/Svneo细胞转染HOTAIR过表达及抑制慢病毒后细胞的增殖功能变化,结果表明HOTAIR过表达或抑制后HTR-8/Svneo细胞的增殖功能未见明显变化。8.Transwell实验结果表明HOTAIR高表达后HTR-8/Svneo细胞的迁移、侵袭功能增强,而抑制HOTAIR表达后HTR-8/Svneo细胞的迁移、侵袭功能减弱。转染miR-152-3p mimics后HTR-8/Svneo细胞的迁移、侵袭功能减弱,而转染miR-152-3pinhibitor后HTR-8/Svneo细胞的迁移、侵袭功能增强。共转染后可部分逆转此种作用。HLA-G高表达后HTR-8/Svneo细胞的迁移、侵袭功能增强,而抑制HLA-G表达后HTR-8/Svneo细胞的迁移、侵袭功能减弱。9 WB实验结果表明HOTAIR高表达后间质标记物中Fibronectin、N-cadherin、MMP9、MMP2表达水平上调,Vimentin表达水平无显著变化,上皮标记物中E-cadherin表达下调;HOTAIR表达抑制后间质标记物中Fibronectin、N-cadherin、MMP9、MMP2表达水平下调,Vimentin表达水平无显著变化,上皮标记物中E-cadherin表达上调。10.WB实验结果表明转染miR-152-3p mimics后间质标记物中Fibronectin、Vimentin、N-cadherin表达水平下调,MMP9、MMP2表达水平无显著变化,上皮标记物中E-cadherin表达上调;转染miR-152-3p inhibitor后间质标记物中Fibronectin、Vimentin、N-cadherin 表达水平上调,MMP9、MMP2 表达水平无显著变化,上皮标记物中E-cadherin表达水平下调。11.WB实验结果表明HLA-G高表达后间质标记物中Fibronectin、N-cadherin、MMP9表达水平上调,Vimentin、MMP2表达水平无显著变化,上皮标记物中E-cadherin表达下调;HLA-G表达抑制后间质标记物中Fibronectin、N-cadherin、MMP9表达水平下调,Vimentin、MMP2表达水平无显著变化,上皮标记物中E-cadherin表达上调。12.共转染后WB实验结果表明HOTAIR+miR-152-3p mimics共转染后与HOTAIR组相比间质标记物中Fibronectin表达下调;HOTAIR+miR-152-3p inhibitor共转染后与HOTAIR组相比间质标记物中N-cadherin表达调;HOTAIR+miR-152-3p inhibitor 共转染后与 HOTAIR+miR-152-3p mimics 组相比间质标记物中Fibronectin、N-cadherin表达上调,MMP2、Vimentin表达水平无显著变化。shHOTAIR+miR-152-3p mimics共转染后与shHOTAIR组相比上皮标记物E-cadherin上调,间质标记物中Fibronectin、N-cadherin表达下调,MMP2上调;shHOTAIR+miR-152-3p inhibitor 共转染后与 shHOTAIR 组相比 EMT 相关蛋白未见明显异常;shHOTAIR+miR-152-3p inhibitor 共转染后与shHOTAIR+miR-152-3p mimics组相比上皮质标记物E-cadherin表达下调,间质标记物N-cadherin表达上调,MMP2表达下调。13.NK细胞毒性实验结果表明HLA-G高表达后HTR-8/Svneo细胞的溶解率降低,而抑制HLA-G表达后HTR-8/Svneo细胞的溶解率增加。[结 论]1.子痫前期胎盘组织lncRNA、miRNA及mRNA表达异常,HLA-G在子痫前期胎盘中低表达,且免疫相关通路、细胞粘附、凋亡等通路可能与重度子痫前期的发病机制相关。2.HOTAIR通过miRNA-152-3p靶向调控HLA-G的表达。3.高表达或抑制HOTAIR对HTR-8/Svneo细胞增殖功能无明显影响。4.高表达HOTAIR、HLA-G及抑制miR-152-3p的表达可通过促进EMT过程增加HTR-8/Svneo细胞的迁移、侵袭功能,而抑制HOTAIR、HLA-G表达及促进miR-152-3p的表达可通过减弱EMT过程抑制HTR-8/Svneo细胞的迁移、侵袭功能。HOTAIR通过miR-152-3p调控HLA-G的表达促进EMT过程增加滋养细胞的迁移、侵袭功能。5.HLA-G高表达后可保护HTR-8/Svneo细胞避免NK细胞的杀伤,而抑制HLA-G表达后HTR-8/Svneo细胞的溶解率增加。6.HOTAIR通过miR-152-3p调控HLA-G的表达差异子痫前期的发病机制。