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费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium.fredii)HN01是一株快生型大豆根瘤菌,因其生长快,胞外多糖少,十分适合商业应用。固氮酶基因(nif基因)在根瘤菌固氮中起着重要的作用,本文利用自杀质粒诱变的方法对费氏中华根瘤菌HN01的固氮酶基因nifR3在结瘤、固氮中的作用进行了研究,并对其上游序列P1的启动子活性进行了测定。我们依据根瘤菌属和中华根瘤菌属的nifR3家族保守序列设计引物,以费氏中华根瘤菌HN01的质粒为模版扩增,对其测序,获得一个完整的ORF,长1014bp,与Sinorhizobium medicae 1021的nifR3的序列在核苷酸水平上有80%的同源性,在氨基酸上有83%的同源性,命名为nifR3。同时得到其上游一段长286 bp的序列P1,在网上预测P1是启动子的最高得值为0.94。将启动子疑似序列P1连接表达载体pLARF6-GUS,获得融合质粒pLARF6—GUSP1,以测定P1的启动子活性。利用β-Glucuronidase对P1进行了启动子活性测定。结果表明,长280 bp的P1序列具有启动子活性。利用pK18mob构建nifR3基因的突变质粒,经三亲本接合导入HN01,获得突变菌株HNR33。通过PCR扩增,得到含有完整nifR3的片段,连接到表达载体pLAFR3上,获得互补质粒pHNBR3。以互补质粒为供体,通过三亲本接合导入突变株HNR33,获得互补株HNBR3。通过对出发菌株HN01、突变体HNR33和互补菌株HNBR3进行生长影响的测试,发现都能正常生长在完全培养基上,达到稳定期的时间大概为30小时。当分别以硝酸盐和铵盐为唯一氮源时,突变体的生长状况与出发菌株的生长情况相似,说明nifR3基因对不同氮源利用的影响不大。通过植株试验,发现HNR33完全现瘤时间比出发菌株HN01晚1天,平均瘤重比HN01少0.082克,平均瘤数比HN01少4个,固氮酶酶活性也比野生菌株HN01的低。这表明nifR3基因与HN01的结瘤效率和固氮酶活性有关,并对结瘤有影响。