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【摘要】目的通过对大鼠进行皮下注射D-半乳糖(D-Galactose,D-gal),建立大鼠肝损伤的模型。用文王一支笔的提取物液进行干预,观察肝损伤大鼠肝组织相关蛋白和病理形态的改变,探讨文王一支笔对肝损伤大鼠肝脏的保护作用及可能的机制,为中医药治疗肝损伤提供理论和实验依据。方法选取雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只,根据随机数字表法将其均分为正常组,模型组,文王一支笔低、中、高剂量组,阳性对照组(n=10)。对模型组、文王一支笔各剂量组及阳性对照组的大鼠分别进行100 mg/kg D-gal皮下注射构建肝损伤模型。同时,文王一支笔低、中、高剂量组分别给与50、100、200 mg/kg文王一支笔溶液灌胃干预,阳性对照组给予0.05mg/kg亚硒酸钠灌胃处理。正常组、模型组给予等体积蒸馏水灌胃,持续42d。动物麻醉后灌注取材,采集心脏血检测血清ALT、AST、DBIL;HE染色观察肝组织的形态;免疫组化染色检测脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、特异性酪氨酸激酶B受体(Tyrosinekinase receptor B,Trk B)在肝组织中的表达及分布;TUNEL染色检测肝细胞凋亡的情况;蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)检测Bax、Bcl-2、Caspase-3、BDNF、Trkb蛋白的表达;硫代巴比妥酸法、黄嘌呤氧化酶法分别测定肝组织内MDA含量、SOD活性。结果1大鼠肝损伤一般情况:正常组大鼠举止行为敏捷、灵活,毛发色泽明亮,进食和饮水如常,体重增加。与正常组相比,模型组大鼠活动较少,毛发较稀疏,有脱毛表现,进食偏少。与模型组相比,文王一支笔和亚硒酸钠干预后,上述状态均有明显改善,体重也相对增加。2血清检测结果:与正常组相比,模型组大鼠血清中ALT和AST的活性和DBIL的含量明显升高(P<0.05),说明D-gal对大鼠肝功能有明显的影响,提示D-gal诱导的肝损伤造模成功。与模型组相比,文王一支笔低、高剂量组和亚硒酸钠组(阳性对照组)大鼠血清中ALT、AST活性降低(P<0.05),且DBIL的含量也呈现降低的趋势(P<0.05)。与模型组相比,文王一支笔中剂量组大鼠血清中ALT、AST活性明显降低(P<0.05),且DBIL的含量也呈现显著降低的趋势(P<0.05)。3形态学变化:(1)大鼠肝脏解剖变化:正常组大鼠肝脏红润,表面光滑,富有弹性,并无病变;与正常组相比,模型组大鼠肝脏泛黄;与模型组相比,文王一支笔低、中、高剂量组和亚硒酸钠组大鼠的肝脏有所改善。(2)肝组织切片HE染色结果:正常组大鼠肝小叶结构清晰,肝细胞排列整齐,细胞核大而圆,无炎性浸润和病理变化。模型组肝损伤大鼠肝小叶结构不完整,排列紊乱,并出现细胞体积肿胀增大、变性、坏死等现象,可见少许淋巴细胞浸润。药物干预后,文王一支笔各剂量组和亚硒酸钠组可不同程度地改善肝脏受损情况。与模型组相比,文王一支笔低、中、高剂量组和亚硒酸钠组可见较为清晰的肝小叶结构,细胞排列相对整齐,且细胞体积肿胀增大、变性、坏死等情况有所减轻。(3)肝组织BDNF、Trk B的免疫组化结果:在正常组中,大鼠肝组织中无BDNF、Trk B的表达;与正常组相比,模型组大鼠肝组织中BDNF、Trk B阳性表达颗粒明显增多,呈特异性的黄色或棕黄色。与模型组相比,文王一支笔低、高剂量组和亚硒酸钠组大鼠肝组织中BDNF、Trk B阳性表达颗粒降低,且呈现淡黄色。与模型组相比,文王一支笔中剂量组大鼠肝组织中BDNF、Trk B的阳性表达颗粒显著降低,且呈现微黄色。(4)TUNEL检测结果:与正常组相比,模型组肝细胞凋亡明显增多(P<0.05);与模型组相比,文王一支笔低、高剂量组和亚硒酸钠组凋亡细胞降低(P<0.05);与模型组相比,文王一支笔中剂量组细胞凋亡叶显著降低(P<0.05)。4大鼠血清中SOD和MDA水平的影响:与正常组相比,模型组肝组织中SOD活性明显降低(P<0.05),模型组肝组织中MDA含量明显增加(P<0.05)。与模型组相比,文王一支笔低、高剂量组和亚硒酸钠组肝组织中SOD活性升高(P<0.05),MDA含量降低(P<0.05);与模型组相比,文王一支笔中剂量组肝组织中SOD活性明显升高(P<0.05),MDA含量明显降低(P<0.05)。5 Western Blot结果:与正常组相比,模型组大鼠肝组织中的Bcl-2表达量显著下降,Bax、Caspase-3的表达量显著上升(P<0.05),提示肝损伤大鼠肝细胞凋亡显著。与模型组相比,文王一支笔低、中、高剂量组和亚硒酸钠组的Bcl-2表达量均明显上升(P<0.05),BAX和Caspase-3的表达明显降低(P<0.05)。正常组中BDNF、Trk B均无表达;与正常组相比,模型组内BDNF、Trk B蛋白的表达明显升高(P<0.05);与模型组相比,文王一支笔低、中、高剂量组和亚硒酸钠组的BDNF、Trk B的表达含量显著降低(P<0.05)。结论文王一支笔可以通过提高肝组织Bcl-2的表达、抑制Bax和Caspase-3的表达,提高SOD的活性,降低MDA的含量,具有抑制肝细胞凋亡的作用。文王一支笔提取物对肝脏的保护可能与降低肝细胞BDNF和Trk B的表达有关。