研究背景：急性髓系白血病(AML)是一种极度危害人类健康的恶性克隆性血液系统疾病。尽管随着科学技术的进步,近几年关于AML发病机制与预后的研究都取得了革命性的进展,患者的完全缓解率有所提高,但难治与复发、对化疗药物的耐药依旧是当前临床治疗的难点。因此,探求AML发生发展的具体机制,寻找敏感的预后指标及特异性治疗靶点成为目前研究的重中之重。ZHX2是一种新近发现的转录抑制因子,参与多种恶性肿瘤发生及发展,且与Notch信号通路相互联系。核因子-YA (NF-YA)是NF-Y的一个亚单位,能够激活多种造血干细胞(HSC)调控基因,并促使HSC自我更新,进一步研究发现造血干细胞中NF-YA的过表达可激活Notch信号通路的转录。ZHX2能与NF-YA结合发挥转录抑制功能。我们前期研究发现,AML患者Notchl/DLL4信号通路异常激活,但ZHX2分子对于Notch1/DLL4信号通路的具体作用及其与AML发生发展及耐药的关系尚不明确,仍有待进一步研究。研究目的：检测ZHX2分子在成人非M3型AML患者中的表达情况,探讨ZHX2与疗效及预后因素的关系,明确ZHX2对AML细胞生物学行为的影响,进一步阐明ZHX2分子对Notch1/DLL4信号通路分子的表达调控作用。预期目标的实现将揭示ZHX2分子在AML发生发展中的作用及具体机制,为AML分子靶向治疗提供新思路。研究方法：1.研究对象选取及标本采集：选取72名成人非M3型初诊AML患者,50名完全缓解AML患者及8名复发患者,分别根据年龄、性别、FAB分型、染色体核型等进行分组,全面采集临床资料,以36例健康志愿者为对照组。收集AML患者组与对照组骨髓标本,采用淋巴细胞分离液分离骨髓单个核细胞(BMMCs)。2.实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Real time RT-PCR)法检测ZHX2和NF-YA基因表达：应用TRIzol方法提取细胞总RNA, M-MLV逆转录酶将RNA逆转录为cDNA,采用Real time RT-PCR检测AML患者骨髓单个核细胞中ZHX2和NF-YA mRNA表达水平,同时以GAPDH为内参。3.分析ZHX2表达与预后的关系：比较非M3型AML患者初诊、完全缓解及复发3种疾病状态的ZHX2 mRNA水平动态变化；根据国际FAB分型,比较不同分型的初诊患者间的ZHX2表达；根据FLT3-ITD突变情况,比较FLT3-ITD阳性及阴性组间的ZHX2表达。4.ZHX2过表达或干扰慢病毒感染AML细胞株：检测Kasumi-1、U937、THP1和K5624种AML细胞株ZHX2表达,ZHX2过表达慢病毒感染ZHX2较低表达的细胞株或ZHX2干扰慢病毒感染较高表达的细胞株,72小时后应用荧光显微镜检测感染病毒的效率,应用嘌呤霉素筛选得到稳定感染的AML细胞株,应用Real time RT-PCR法、Western blot法检测病毒感染稳筛后的ZHX2表达情况。5.CCK-8法检测AML细胞增殖：应用CCK-8法分别检测过表达及下调ZHX2对AML细胞增殖的影响。6.CCK-8法检验AML细胞药物敏感性：将化疗药物去甲氧柔红霉素(IDA)、阿霉素(ADM)、阿糖胞苷(Ara-c)梯度稀释,分别加入ZHX2上调组或ZHX2下调组及其各自对照组,培养72小时后,应用CCK-8法检测AML细胞对不同化疗药物的敏感性。7.流式细胞术检测AML细胞凋亡：分别选取一定浓度化疗药物IDA、ADM、 Ara-c加入ZHX2上调组或ZHX2下调组及其各自对照组,培养48小时后,根据Annexin V/PI试剂盒要求双染色后,应用流式细胞仪检测AML细胞的早期凋亡率与晚期凋亡率。8. Western blot法检测Notch 1/DLL4信号通路分子表达：利用细胞总蛋白裂解液分别提取ZHX2上调组与下调组细胞及相应对照组的总蛋白,应用Western blot方法检测AML细胞中Notch1、NF-YA和DLL4蛋白水平的表达变化。研究结果：1. Real time RT-PCR结果显示,非M3型初诊AML患者与复发患者的BMMCs中ZHX2分子mRNA表达水平均明显低于健康志愿者；完全缓解AML患者ZHX2表达水平明显高于非M3型初诊患者和复发患者；健康志愿者BMMCs中ZHX2分子的表达与完全缓解患者相比较表达水平无明显统计学差异。然而初诊组、完全缓解组、复发组与健康志愿组4组间的NFYA-L、NFYA-S分子mRNA水平均无明显的统计学差别。2.与健康志愿者相比,M2、M4、M5型初诊AML患者ZHX2 mRNA表达降低,其中M5型患者表达最低。FLT3-ITD阳性组患者的ZHX2 mRNA表达低于FLT3-ITD阴性组患者。初诊AML患者接受治疗达到完全缓解后其ZHX2表达水平升高,当患者复发,其ZHX2表达水平随之降低。3. Real time RT-PCR、Western blot结果显示ZHX2过表达慢病毒可有效上调AML细胞株U937中ZHX2 mRNA和蛋白表达水平,干扰ZHX2慢病毒可显著下调AML细胞株THP1中ZHX2 mRNA和蛋白表达水平。4.CCK-8法检测细胞增殖发现,过表达ZHX2可有效抑制AML细胞增殖速率,延长倍增时间；抑制ZHX2表达可促进AML细胞增殖速率,提高肿瘤的倍增时间。5.CCK-8法检测细胞化疗药物敏感性发现,ZHX2的过表达明显提高了AML细胞对不同化疗药物(ADM、Ara-c、IDA)的敏感性；抑制ZHX2表达明显降低了AML细胞对化疗药物(ADM、Ara-c、IDA)的敏感性,使细胞呈现耐药状态。6. Annexin V/PI流式检测细胞凋亡发现,ZHX2上调组的AML细胞株早期、晚期凋亡率与对照组相比均明显升高,而ZHX2下调组的AML细胞株早期、晚期凋亡率均低于对照组。7. Western blot结果表明,ZHX2表达上调后,Notch 1与DLL4蛋白表达水平明显降低；ZHX2表达下调后,Notch 1与DLL4蛋白表达水平明显增高。干预ZHX2表达后,NF-YA表达无明显变化。结论：1.非M3型初诊及复发AML患者存在ZHX2分子低表达,且其表达水平与预后相关,提示ZHX2分子可能参与AML的发生发展,有望成为判断AML患者预后的新指标。2.ZHX2过表达可抑制AML细胞增殖,增强AML细胞对化疗药物的敏感性及其诱导的细胞凋亡；ZHX2表达下调可促进AML细胞增殖,减弱AML细胞对化疗药物的敏感性及其诱导的细胞凋亡,提示ZHX2分子在AML的发生发展及耐药中发挥重要作用,有望成为AML逆转耐药的新靶点。3.ZHX2分子可能通过调控Notch1/DLL4信号通路,影响AML细胞增殖、耐药,其具体调控机制有待进一步探究。