纸基分析装置(PADs)是一种以纸张作为基底材料的分析检测技术,具有成本低、操作简单、便携性好、可一次性使用等优点,广泛应用于疾病诊断、环境监测和食品质量控制领域。其中,纸芯片结合了传统微流控芯片的优点(微型化、高通量、高度集成化)和纸张的独特优势(廉价易得、生物相容性好、无需外加动力),其发展已从制作方法的探究深入到实际应用。比色法、电化学法、化学发光法、电化学发光法、荧光法等分析方法在纸芯片中均得到应用。荧光共振能量转移(FRET)是一种重要的荧光分析方法,被认为是1-10nm范围内有效的“光学分子尺”,具有操作简单、检测速度快、灵敏度高等优势。FRET不仅在均相检测体系中得到广泛应用,在纸基分析方法中也逐步得到发展,应用于金属离子、小分子、生物大分子、细胞及病原体的检测。然而,现有的纸基FRET分析方法多采用传统的下转换荧光团如有机分子、量子点、荧光碳纳米材料等作为能量供体,存在一些不可避免的缺陷。此类材料通常采用紫外光或可见光作为激发光源,纸张中的荧光添加剂和纸张基底的散射光会对检测结果造成干扰；同时,生物样本的本底荧光和散射光也会对检测体系产生影响；此外,当受体和供体的激发光谱存在一定程度的重叠时,能量受体可能会被直接激发,产生假阳性信号。这些干扰因素限制了纸基FRET传感器的应用,尤其是在复杂样本直接检测中的应用。上转换纳米颗粒(UCNPs)是一类稀土离子掺杂的反斯托克斯发光的无机纳米材料,可以在近红外或红外光的激发下发射出可见光。UCNPs近红外光激发的特性使其可以有效地避免来自生物样本及能量受体的干扰,是一类极有发展潜力的FRET体系能量供体。以UCNPs作为能量供体的均相FRET分析方法已成功应用于核酸杂交、免疫分析及其它生物医学分析领域,并取得令人欣喜的结果,而将UCNPs作为纸基FRET体系的能量供体依然是一个全新的方向。UCNPs可以克服纸张添加剂和散射光的干扰,纸基UC-FRET分析方法有望结合UC-FRET和PADs的共同优势,发展成可用于复杂样本直接检测的纸基分析装置,给POCT行业带来新的发展机遇。鉴于此,本文针对纸基FRET体系中复杂生物样本背景干扰的问题,将上转换纳米颗粒(UCNPs)作为纸基FRET体系的能量供体,建立新型纸基UC-FRET分析方法,分别以有机染料、碳纳米材料、纳米金为能量受体,利用酶切多肽底物、适配体识别、免疫反应等多种不同的识别机理构建纸基UC-FRET传感器,用于复杂样本中目标物的分析检测,并充分利用UCNPs可见光发射的性质,简化检测装置,构建便携式的纸基UC-FRET传感器,实现复杂样本中目标物的可视化检测。主要研究内容如下：1.提出以UCNPs作为纸基FRET体系的能量供体,设计以有机染料四甲基罗丹明(TAMRA)为能量受体的纸基UC-FRET传感器,利用酶切多肽底物的原理实现人基质金属蛋白酶2(MMP-2)的检测。通过一步绘图法在普通复印纸上制备纸芯片,考察UCNPs在纸基检测区域中的光稳定性和负载牢固程度；将TAMRA修饰的多肽底物偶联在UCNPs表面,拉近能量供受体之间的距离,UCNPs的荧光被猝灭；将偶联产物负载于纸基检测区域中,考察偶联产物在纸基检测区域中的光稳定性；向负载有偶联产物的检测区域中加入MMP-2后,多肽底物被切断,供受体之间的距离增大,UCNPs的荧光恢复,根据荧光信号的变化实现MMP-2的定量检测。该传感器在缓冲溶液中检测的线性范围为50-5000pg/mL,检出限为8.3 pg/mL,同时还用于复杂血液样本(血清和全血)中MMP-2的检测,检测结果与缓冲溶液中相当。与均相检测体系相比,纸基UC-FRET传感器的所需样本体积更少,检测速度更快,同时还可以保持较高的灵敏度,验证了UC-FRET技术在纸基分析装置中应用的可行性。2.在所构建的纸基UC-FRET体系中引入碳纳米材料作为能量受体,探索碳纳米材料在纸基表面的猝灭能力。分别选取碳纳米颗粒(CNPs)和氧化石墨烯(GO)为能量受体,基于适配体识别机理构建纸基UC-FRET传感器,用于人免疫球蛋白E(IgE)和癌胚抗原(CEA)的检测。在UCNPs表面偶联适配体,将偶联产物负载于纸基检测区域中,向检测区域加入碳纳米材料,适配体和碳纳米材料通过π-π堆积作用组装在一起,UCNPs的荧光被猝灭,加入目标物后,适配体与目标物结合发生构象变化,供受体之间距离增大,荧光恢复,根据适配体结合目标物前后UCNPs荧光强度的变化实现目标物的定量检测。在0.5-80ng/mL浓度范围内,UCNPs的荧光恢复程度与IgE浓度线性相关。将该传感器用于复杂血清样本中IgE的定量检测,并将检测结果与临床提供结果进行对比,取得了令人满意的结果,进一步拓展纸基UC-FRET传感器的应用范围。3.将所构建的纸基UC-FRET分析方法的应用范围拓展至免疫分析领域,以纳米金(AuNPs)作为能量受体,基于抗原抗体特异性识别的原理构建纸基UC-FRET免疫传感器,用于癌胚抗原(CEA)的检测。在供受体表面分别偶联CEA包被抗体和识别抗体,将偶联抗体的UCNPs负载于纸基检测区域中,利用两种抗体对CEA的共同识别作用,拉近UCNPs与AuNPs之间的距离,使UCNPs的荧光被猝灭,荧光猝灭程度与CEA浓度存在相关性,据此进行CEA的检测。在0.5-30ng/mL浓度范围内,UCNPs的荧光猝灭程度与CEA浓度线性相关。所构建的传感器可用于血清中CEA的定量检测,同时也可用于临界浓度CEA的裸眼定性判断,对疾病的早期筛查和临床诊断具有重要的价值。4.在上一章的基础上,简化纸基UC-FRET传感器的检测装置,构建便携式检测方法,拓展纸基UC-FRET技术的应用。我们继续以纳米金为能量受体,构建可视化的纸基UC-FRET传感器,将智能手机作为信号收集装置,用于可卡因的可视化检测。通过合理设计,将可卡因适配体分成两条独立序列ACA-1和ACA-2,将UCNPs和ACA-1共价偶联在纸基表面,ACA-2偶联在AuNPs表面得到AuNPs-ACA-2,当纸基检测区域中同时存在可卡因和AuNPs-ACA-2时,可卡因可以和两条适配体结合形成二级结构,拉近供受体之间的距离,UCNPs的荧光被猝灭。利用智能手机拍摄检测区域的荧光图片,根据荧光图片的颜色进行可卡因的可视化检测,并通过简单的数据处理实现定量检测。该传感器可用于缓冲溶液中可卡因的检测,线性范围为0.01-5μM,还可用于复杂样本(唾液)中可卡因的定量检测,在0.05-5 gM浓度范围内,UCNPs的荧光猝灭程度与可卡因浓度的对数间呈线性关系,此外,还可以对大鼠血浆中可卡因含量的变化进行监测。与物理吸附方法相比,UCNPs的共价偶联可以增加其在纸张表面分散的均匀程度,提高检测结果的稳定性。所构建的传感器检测灵敏度高,检测速度快,检测仪器简单便携,在现场检测领域具有极大的发展潜力。