【摘 要】
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拟南芥（Arabidopsis thaliana）作为模式植物,已被广泛应用于植物分子生物学、遗传学和发育生物学的研究。拟南芥的未知功能基因的研究通常是通过转基因技术进行。本研究应用分子生物学、生物信息学分析并构建了拟南芥未知功能基因AtBNU-X的各种植物表达载体,转化农杆菌之后浸染花序,获得了转基因植株,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。主要的研究结果如下： （1） AtBNU-X基
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拟南芥（Arabidopsis thaliana）作为模式植物,已被广泛应用于植物分子生物学、遗传学和发育生物学的研究。拟南芥的未知功能基因的研究通常是通过转基因技术进行。本研究应用分子生物学、生物信息学分析并构建了拟南芥未知功能基因AtBNU-X的各种植物表达载体,转化农杆菌之后浸染花序,获得了转基因植株,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。主要的研究结果如下： （1） AtBNU-X基因的生物信息学分析；其cDNA序列全长1219 bp,其中5’端非编码区76bp,3’端非编码区351bp,一个完整的开放阅读框792bp,编码263个氨基酸,推测蛋白质分子量为29.03KDa。其蛋白质二级结构主要以α螺旋和p折叠为主,不具有跨膜域。推测该蛋白可能的磷酸化位点共有23个,亚细胞定位于细胞核。 （2） RT-PCR检测AtBNU-X基因对逆境胁迫的响应；结果显示在4℃冷处理、NaCl（?）（?）甘露醇处理12小时后,该基因在根和绿色组织中的表达量都显著升高；而在38℃热处理3小时,该基因在根和绿色组织中的表达量都有所降低。我们分析AtBNU-X基因可能与植物抗逆性相关。 （3）利用Gateway技术构建过表达载体及转化拟南芥；以含有35S启动子的植物表达载体pEarlygate101为基础,分别成功构建了拟南芥基因AtBNU-X和同源基因AtBNX的过量表达载体pEarlygate101-AtBNU-X和pEarlygate101-AtBNX。然后用花序浸染法转化拟南芥,在含Basta抗性的1/2MS培养基上筛选T1代转基因植株,发现转化植株个体较大,子叶较绿,而未转化植株逐渐死亡。结果分别获得了3株和3株的T1代转基因植株,T2代转基因植株分别和野生植株比较,形态上没有明显差异,现在正在筛选T3代纯合体。 （4）利用Artificial microRNA技术构建RNA干扰载体及转化拟南芥；以pGEM-Teasy为中间载体,分别成功构建了拟南芥RNA干扰载体：pSN1301-Ami-AtBNU-X、pSN1301-Ami-AtBNX和pSN1301-Ami-AtBNU-X/AtBNX,并转化野生型拟南芥。经潮霉素抗性筛选,发现阳性转化植株生根并长出真叶,而非转化植株则逐渐枯萎死亡。结果干扰载体pSN1301-Ami-AtBNU-X获得了12株含潮霉素抗性的T1代转基因植株,T2代转基因株系表现出明显3：1分离比,但和野生植株比较,没有明显的表型差异；而干扰载体pSN1301-Ami-AtBNU-X/AtBNX获得了3株含潮霉素抗性的转基因T1代植株,现在正在培养中。 （5）构建启动子融合GUS表达载体及转化拟南芥；以拟南芥基因组DNA为模板,用PCR扩增AtBNU-X基因上游2.0Kb的启动子序列,克隆到含有GUS报道基因的表达载体pMDC163中,成功构建了pMDC163-AtBNU-X表达载体。经潮霉素抗性筛选,现已获得3株T1代转基因植株。
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