研究背景和目的：:　　 类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节滑膜炎为特征的慢性全身性自身免疫性疾病。以慢性、对称性、多滑膜关节炎和关节外病变为主要临床表现,滑膜炎持久反复发作,可导致关节内软骨和骨的破坏,关节功能障碍,甚至残废。该病好发于手、腕、足等小关节,反复发作,呈对称分布。血管炎病变累及全身各个器官,故本病又称为类风湿病。RA呈全球性分布,国外本病的患病率约为1％～2％,我国初步调查发现患病率为0.32％～0.34％,虽低于国外,但由于我国人口众多,估计患者总数约有360万之多,如此庞大的RA患病人群每年都给我国社会、经济造成巨大的损失,也是造成我国人群丧失劳动力和致残的主要病因之一。RA病因未明,目前多认为遗传、感染、环境和激素四大因素的交互作用是参与RA发病的重要因素,文献报道遗传因素可以解释的易感性占50-60％。　　 最近研究发现,蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型22(protein tyrosine phosphatasenonreceptor 22,PTPN22)基因的一个单核苷酸多态性,即1858C转换为1858T(rs2476601),使密码子620编码的P1基序中一个高度保守的关键氨基酸由精氨酸转变为色氨酸(R620W),导致Lyp不能正常发挥作用,增加了个体对自身免疫性疾病的易感性。PTPN22基因定位于1号染色体短臂1区3带(1p13.1～1p13.3)上,编码淋巴细胞特异性的蛋白酪氨酸磷酸酶(lymphoid proteintyrosine phosphatase,Lyp)。LYP从属于蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)家族,是造血组织细胞特异性的PTPs,LYP主要通过C端命名为P1的富含脯氨酸基序与CSK蛋白酪氨酸激酶的SH3结构域连接,使已磷酸化的Src家族Lck、Fyn和ZAP-70激酶脱磷酸化,同时协同CSK抑制T细胞活化,在T细胞活化的信号传导中起到重要的负调节作用,一旦PTPN22基因发生变异,Lyp的功能或表达量发生改变,可引起T细胞信号传导障碍,导致自身免疫性疾病的发生。　　 为此,本课题拟增加RA患者病例数,同时我们还选取国外文献中发现的与自身免疫性疾病相关联的新的PTPN22基因SNP位点(rs33996649和rs1310182),采用PCR-RFLP技术结合测序技术来检测这三个位点在RA患者和健康人群中中的分布差异,分析它们与广东地区人群RA发病的相关性；采用荧光定量PCR技术对PTPN22基因的表达水平进行相对定量来了解rs2488457/-1123G>C与基因表达之间的关联；联合RF、anti-CCP、GPI、血沉(ESR)和C-反应蛋白(CRP)等的检测,研究其早期诊断价值及特异性,为临床RA的早期诊断、治疗提供依据。　　 方法:　　 1.研究对象　　 收集广州南方医院风湿科2008年1月～2010年1月门诊及住院RA患者494例,其中男性75例,女419例,年龄3～84岁,平均年龄44.99±0.65岁；所有RA患者均符合1987年美国类风湿病协会(ARA)修订的RA诊断分类标准及2009年ACR/EULAR联合颁布新的RA诊断标准。对照组选择496例健康查体者,男性99例,女性397例,年龄7～82岁,平均年龄:43.52±0.60。研究对象均为广东地区汉族人群,无亲缘关系,两组年龄、性别差异无统计学意义(p>0.05),健康对照组排除了除RA外的自身免疫性疾病患者。　　 2.研究方法:　　 2.1 采用PCR-RFLP技术结合测序技术检测三种SNP基因型　　 选取国外文献中新发现与自身免疫性疾病相关联的PTPN22基因SNP位点(rs2488457,rs33996649和rs1310182),采用PCR-RFLP技术结合测序技术来检测这三个位点在两组中的分布。根据SNP位点上是否存在核酸内切酶的酶切位点,利用软件primer premier 5.0设计针对三种SNP靶片段上的引物,对研究对象的DNA进行扩增,用核酸内切酶消化PCR产物,消化产物琼脂糖凝胶电泳观察结果。随机抽取10％测序,与PCR-RFLP结果对比。　　 2.2 采用SYBR Green荧光染料法检测PTPN22基因相对表达量　　 根据PTPN22 mRNA序列设计扩增引物,以管家基因GAPDH为内参,采用2-△△CT分析方法对PTPN22基因的表达量进行相对定量。比较PTPN22mRNA的相对表达量在-1123G>C三种基因型之间的差别。　　 2.3 采用ELISA法检测患者血浆GPI水平　　 收集患者血清,以PTPN22-1123G>C多态性位点将RA分为三组,另外设置健康对照组和非RA的自身免疫性疾病对照组,共5组,用ELISA法检测各组血浆样本中GPI的相对表达量。　　 2.4 临床特征分析　　 以PTPN22 G-1123C多态性位点将RA分为三组,同时我们以RF、anti-CCP、血沉(ESR)、C-反应蛋白(CRP)、X线损伤等指标阳性时和阴性时,比较PTPN22 G-1123C多态性位点的基因型分布在病例组和对照组之间的差异。　　 3.统计方法　　 应用SPSS13.0统计软件包处理数据。计量资料用均数±标准差(x±s)表示,计数资料用率表示。RA组及健康对照组三个SNP位点基因型频率经Hardy-WeinbeB遗传平衡定律检验样本是否具有群体代表性；三个SNP位点基因型分布以及等位基因频率在两组之间的比较采用R×C列联表的x2检验；对于样本含量<40和理论数<1的计数资料采用列联表的精确概率法；各组间均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),方差分析显著时进行多重比较,方差齐采用Bonferroni法,方差不齐采用Games-howell法。以P<0.05为差异有统计学意义；构成比的比较采用卡方分析(Chi-square test)。　　 结论:　　 1.PTPN22-1123G>C与广东地区汉族人群RA的发病有关联,并且具有明显的杂合子优势,由于CG基因型在RA和对照组中的分布分别为45.7％和37.5％,说明PTPN22-1123G>C可能只是一种低危险度的SNP。PTPN22-1123G>C与中国人群RA易感性的关联可能具有普遍性。　　 rs1310182与中国广东人群RA发病不具有关联性。　　 rs33996649与中国广东人群RA发病无关联性。　　 2.PTPN22-1123G>C可能使PTPN22 mRNA的表达异常,而且,PTPN22mRNA和血清GPI的变化趋势一致,表明Lyp的表达量与GPI的产生具有相关性。　　 3.我们尚未发现PTPN22-1123G>C与RA患者anti-CCP、ESR、CRP以及X线损伤之间的关联。　　 本研究创新点:　　 1.增加了大量的病例数进一步证实PTPN22-1123G>C多态性与中国广东人群RA发病相关。　　 2.发现PTPN22-1123G>C多态性可能改变PTPN22启动子的转录调节功能。野生型G等位基因转变为C等位基因后,表达下调。　　 3.发现PTPN22-1123G>C与RA患者血清中GPI的浓度相关,PTPN22 mRNA水平的变化趋势与血清GPI的水平一致,为探讨Lyp与GPI之间的关系提供依据。