论文部分内容阅读
共轭亚油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是一组天然存在于牛肉、奶酪和乳脂中多不饱和脂肪酸，是亚油酸(Linoleic acid，LA)的几何异构体和位置异构体。其中，c9，t10-CLA和t10，c12-CLA是迄今为止证明的具有主要活性的单体。近来研究证实CLA具有显著的抗肿瘤活性并引起了极大关注。但这方面研究主要集中于CLA在胃肠道肿瘤，黑色素瘤，前列腺癌等，而对宫颈癌，鼻咽癌等这类高发肿瘤的影响尚无报道，且CLA单体在细胞增殖和凋亡方面的研究主要集中在ERK-MAPK和NF-kB信号通路。本实验探索了CLA更广泛的抗肿瘤作用，并首次揭示了CLA两种异构体的肿瘤促凋亡作用与PPARy高表达的关系。
一、CLA在多种肿瘤细胞中促凋亡作用初探。
体外培养肿瘤细胞系Hela，SKBR3，MCF-7，CNE2，U251，利用MTT和台盘兰染色细胞计数法测定细胞增殖抑制率，Hochest染色观察细胞核形态学变化，RT-PCR检测凋亡相关基因bcl-xL/S的mRNA转录水平，流式细胞术检测细胞周期。
研究结果发现，CLA对Hela、MCF-7、SKBR3、U251和CNE2细胞都有抑制作用，且抑制作用呈剂量依赖性。其中对Hela，MCF-7和SKBR3细胞抑制率最显著，CNE2和U251最弱；细胞周期研究表明，CLA仅引起Hela、SKBR3和MCF-7的细胞周期变化，表现为S期延长，Go/G1缩短；从bcl-x mRNA转录水平来看，Hela细胞的促凋亡基因bcl-χ1S转录随CLA浓度的增加而逐渐增强，抑凋亡基因bcl-χL基本无变化，而SKBR3和MCF-7细胞则是bcl-χL逐渐减弱， bcl-χS基本无变化；CNE2和U251细胞的bcl-χS/L都未见明显变化。以上结果显示了CLA对Hela、MCF-7、SKBR3细胞具有明显的抗肿瘤作用。
二、共轭亚油酸两种单体(c9,t11-CLA和禾t10,c12-CLA)在宫颈癌细胞(Hela)和乳腺癌细胞(MCF-7和SKBR3)中的促凋亡作用及其与PPARγ的关系。
在上述结果的基础上，对Hela、SKBR3和MCF-7三个细胞系，进一步考察了c9，t11和t10，c12-CLA分别在细胞增殖抑制率、细胞核形态学变化、bcl-χL/S mRNA转录水平和细胞周期等方面的改变，并进一步检测了凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2、Caspase3的表达，并在计算机模拟预测的基础上，探讨了PPARγ的抑制和激活与凋亡蛋白之间的关系。
结果发现，c9,t11-CLA和t10,c12-CLA均能抑制Hela和SKBR3，MCF-7细胞的生长，其抑制作用程度有所不同；流式细胞周期检测显示，两单体均可将三种细胞阻滞在S期，且相同浓度下t10,c12-CLA延长S期的幅度显著高于c9,t11-CLA，并在Hela中出现明显凋亡峰，最高可达40％；另外，CLA两种异构体均可使上述三种细胞的促凋亡基因bcl-χSmRNA水平转录上调，促凋亡蛋白Bax和Caspase3的表达增加；抑凋亡基因bcl-χL转录下调和抑凋亡蛋白Bcl-2表达减弱，表明CLA对该三种肿瘤细胞的促凋亡作用与细胞内Bax/Bcl-2蛋白水平相关；同时我们发现CLA的作用可使PPARγ表达显著增强。通过PPARγ抑制剂(GW9662)检测，促凋亡蛋白Bax和Caspase3表达显示与PPARγ正相关，抑凋亡蛋白bcl-2则相反；两异构体的差异在于其作用浓度和时间对所检测的蛋白的增强程度不同，c9,t11-CLA最佳作用浓度为100μM，而t10,c12-CLA为50μM。
本文揭示了CLA及其单体c9,t11-CLA和t10,c12-CLA对宫颈癌Hela细胞和乳腺癌细胞SKBR3及MCF-7的促凋亡作用，并证明了c9,t11-CLA和t10,c12-CLA通过激活PPARγ而引起凋亡蛋白Bcl-2家族的变化进而诱发凋亡。这一研究为阐明复杂的肿瘤细胞凋亡机制具有重要的意义，而CLA不同异构体作为抗肿瘤药物在临床应用和肿瘤生物治疗方面提供了有效的理论依据。CLA对Hela细胞的促凋亡作用研究为首次报道。