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背景:阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD）是一种渐进性不可逆转的神经退行性疾病。患者表现为进行性智力、记忆力及认知功能降低,最终丧失思考、说话及活动能力。AD病人的两大特征性病理标志是细胞外老年斑,细胞内神经原纤维缠结。β-淀粉样肽（Aβ）是老年斑的主要成分,Aβ的代谢前体为淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein,APP）。AD的病因复杂,发病机制尚不明确,但是迄今为止Aβ假说仍占主导地位。Aβ是AD的主要病理特征,可通过“病毒样传播”扩散到相邻脑区。内嗅皮层和前穿质通路是AD中最早受累的脑区。在AD患者中,前穿质通路周围有大量的神经纤维缠结,是主要受累的区域。在AD早期,发现前穿质通路的起源和终末端都有淀粉样蛋白沉积,因此早期干预前穿质通路Aβ的生成可能成为治疗AD的潜在靶点。而APP作为Aβ的代谢前体,是Aβ生成的“原料”,在AD的防治过程中也起到了重要作用。明确APP在细胞内的分布、定位和降解,减少APP生成Aβ,是治疗AD的有效策略。Nogo受体（Nogo receptor,NgR）与轴突抑制密切相关,可抑制成年小鼠大脑损伤后轴突的生长和可塑性。有研究报道NgR参与了AD的病理特征,但相关结果并不一致,甚至存在相互矛盾的结论,提示详细的机制尚待进一步研究。本研究主要探究前穿质通路NgR对APP/PS1转基因小鼠的病理和功能表型的影响。方法:1.分子生物学手段将该干扰片段构建入腺相关病毒载体（p AKD-CMV-b Globin-e GFP-H1-sh RNA）的H1启动子下游,该载体可以在干扰Rtn4r基因的同时表达绿色荧光蛋白GFP基因,观察载体工作状态。将表达sh RNA-NgR的腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）和对照病毒通过脑立体定位注入APP/PS1转基因小鼠的前穿质通路,干扰前穿质通路NgR的表达。实验分为APP/PS1转基因小鼠注射对照病毒组（TG-vector）和APP/PS1转基因小鼠注射AAV-sh NgR干扰病毒组（TG-sh NgR）。2.行为学检测TG-vector组和TG-sh NgR组小鼠的学习记忆能力。通过水迷宫检测APP/PS1转基因小鼠的空间学习和记忆能力;通过避暗实验检测APP/PS1转基因小鼠短期记忆能力;通过Y迷宫自发交替实验检测APP/PS1转基因小鼠空间工作记忆。3.电生理学检测TG-vector组和TG-sh NgR组小鼠海马离体脑片的长时程增强（Long-term potentiation,LTP）,观察其突触可塑性的变化。4.高尔基染色观察TG-vector组和TG-sh NgR组小鼠海马脑区树突棘密度的变化,判断海马形态树突棘的可塑性。5.在体微透析技术获取TG-vector组和TG-sh NgR组小鼠的前穿质通路和海马脑区的细胞外液,ELISA试剂盒检测透析液中Aβ1-42的水平,评估各组APP/PS1转基因小鼠脑区细胞外液可溶性Aβ的含量。6.免疫组织化学形态学测试TG-vector组和TG-sh NgR组小鼠的AD病理改变。应用6E10抗体免疫组化染色和免疫荧光染色检测Aβ斑块;GFAP和Iba1抗体免疫组化染色检测小鼠星形胶质细胞GFAP和小胶质细胞Iba1的表达。7.体外敲减或过表达NgR,观察下游相应目标分子的变化。神经母细胞瘤N2a细胞系中通过sh NgR敲低NgR的表达;APPswe/HEK293细胞中si RNA干扰NgR的表达;通过全长质粒转染APPswe/HEK293细胞系过表达NgR的表达水平,Western blot观察目标蛋白表达。8.Western blot检测相关分子蛋白表达水平,分别用APP、s APPβ、s APPα、NgR、BACE1、Rho、ROCK1和ROCK2抗体检测目标蛋白,β-actin作为内参对照;PCR检测相关分子m RNA水平,分别用NgR和APP的引物检测其m RNA水平,GAPDH作为内参。9.免疫荧光双染观察APP和溶酶体标记物（早期内体、晚期内体和溶酶体）在细胞上的共定位。结果:第一部分下调前穿质通路NgR对APP/PS1小鼠认知行为和突触可塑性的影响1.下调前穿质通路NgR改善APP/PS1小鼠的认知障碍行为学水迷宫实验检测发现下调NgR可改善APP/PS1小鼠空间学习和记忆能力（p＜0.05）;避暗实验发现,下调NgR能够改善APP/PS1转基因小鼠短期记忆（p＜0.01）。Y迷宫自发交替实验发现,下调NgR可改善APP/PS1转基因小鼠空间工作记忆（p＜0.05）。2.下调前穿质通路NgR减低APP/PS1小鼠突触可塑性的损伤电生理学检测小鼠LTP的变化,发现APP/PS1转基因AD模型鼠前穿质通路敲减NgR后与未敲减组比较,小鼠海马长时程增强的损害有明显的恢复（p＜0.05）。形态高尔基染色也发现,敲减NgR小鼠CA1和DG脑区树突棘数量明显增多（p＜0.05）,由此得出结论,下调前穿质通路NgR可改善了小鼠的突触可塑性。第二部分下调前穿质通路NgR对APP/PS1小鼠脑内Aβ含量及神经炎症的影响1.下调前穿质通路NgR降低APP/PS1小鼠脑内Aβ的含量在体微透析实验发现,下调前穿质通路NgR表达后,APP/PS1转基因小鼠前穿质通路及海马脑区可溶性Aβ1-42的含量均明显降低（p＜0.05）。与此相一致的是,免疫组化神经病理的结果也显示,TG-sh NgR组比TG-vector组APP/PS1转基因小鼠前穿质通路、海马和皮层脑区Aβ斑块沉积明显减少（p＜0.05）,提示下调前穿质通路NgR后,APP/PS1小鼠脑内Aβ的含量明显降低。2.下调前穿质通路NgR能够改善APP/PS1小鼠脑内神经炎症反应敲低NgR的表达后,Western blot和免疫组织化学染色结果均发现APP/PS1转基因小鼠海马脑区GFAP和Iba1表达明显降低（p＜0.05）,提示小胶质细胞和星形胶质细胞的激活被抑制。第三部分下调前穿质通路NgR抑制APP/PS1小鼠Aβ生成的机制研究1.NgR对APP及相关剪切蛋白表达的影响在体实验发现,病毒干预下调APP/PS1转基因小鼠脑内NgR的表达后,APP及相关剪切蛋白的表达水平降低（p＜0.05）,而APP的m RNA水平却无明显改变。进一步研究发现,N2a细胞系中通过sh RNA干扰NgR的表达后APP表达降低（p＜0.05）;si RNA干扰APPswe/HEK293细胞系NgR的表达后,APP蛋白水平也明显减低（p＜0.001）。与此相一致的是,APPswe/HEK293细胞过表达NgR后APP蛋白水平升高（p＜0.05）,m RNA亦无明显变化。2.NgR通过调控APP的转运减少Aβ的生成APP/PS1转基因小鼠下调前穿质通路NgR的表达后Rho和ROCK2的表达明显下降（p＜0.05）。APPswe/HEK293细胞系过表达NgR后,给予ROCK1和ROCK2的拮抗剂进行干预,发现ROCK2拮抗剂可以逆转NgR过表达诱导的APP蛋白水平升高（p＜0.05）。免疫荧光结果也显示,下调NgR后减少了APP与EEA1的共定位,而APP与LAMP1的共定位显著增加（p＜0.05）。下调NgR也提高了与Rab7阳性区室的APP共定位,但差异无统计学意义。提示,敲减NgR表达可以促进APP流向溶酶体。结论:APP/PS1转基因小鼠前穿质通路NgR,可抑制APP流向溶酶体进行降解,增加Aβ的产生,进而影响其认知功能。定点敲减前穿质通路中的NgR可改善AD模型鼠的学习记忆功能,此研究为AD的发病机制及治疗提供了很好的研究基础及潜在治疗靶点。