背景和目的急性肾损伤是一种常见的临床综合征,也是危重症患者常见的并发症和重要的死亡原因。缺血性损伤是急性肾损伤的主要发病机制,而缺氧是缺血性损伤中最为关键的环节。肾脏的管状上皮细胞的高水平氧耗量及肾脏的特殊脉管系统结构使得肾脏对缺氧非常敏感,而且近曲肾小管上皮细胞对缺血性损伤尤为敏感。因此,肾小管上皮细胞的缺氧性损伤最为关注,是学术界研究的焦点。铁螯合剂二氯化钴(COCl2)是常用的化学缺氧的模拟剂,在国内外实验研究中已获得广泛应用。建立一个稳定的细胞缺氧模型,为后续研究工作的开展具有重要的意义。本研究旨在通过比较不同COCl2浓度和不同缺氧时间时细胞的生长抑制率和缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)蛋白表达量,来确定后续研究中细胞的最佳缺氧条件材料和方法选取人的近曲肾小管上皮细胞系(HK-2)为实验细胞。实验性缺氧方法为细胞缺氧,即在细胞培养液中加入COCl2。使用含不同COCl2浓度的培养液(终浓度分别为0、50、100、150、300、600μM)培养HK-2细胞,并分别缺氧培养不同时间(0、4、6、12、24、48h),尔后应用MTT试验检测细胞的生长抑制率,同时收集细胞提取核蛋白进行Western免疫印记定量法检测细胞中HIF-1α蛋白表达量。结果1)随着细胞培养液中COCl2浓度的增加,细胞的生长抑制率呈现增加趋势；随着缺氧时间的延长,细胞的生长抑制率也呈现增加趋势。经统计发现,细胞培养液中COCl2浓度在50-300μM与600μM时,细胞的生长抑制率有显著性差异(P<0.05),而CoCl2浓度在50-300μM时,虽然细胞的生长抑制率呈递增趋势,但是差异无统计学意义(P>0.05)。同时,还发现缺氧时间为48h时,细胞的生长抑制率显著高于4-24h(P<0.05)；而在缺氧时间为4-24h时,虽然细胞的生长抑制率亦呈递增趋势,但是差异无统计学意义(P>0.05)。2)在缺氧时间为0-24h之间,随着时间的延长,HIF-1α蛋白表达量渐增加,至24h达到峰值,48h时HIF-1α蛋白表达量较24h减少；当CoCl2浓度为0-150μM时,随着COCl2浓度的增加,HIF-1α蛋白表达量渐增加,当CoCl2浓度达到150μM时,HIF-1α蛋白表达量较CoCl2浓度为300和600μM时亦高。结论最佳缺氧处理条件为细胞培养液中COCl2终浓度为150μM,缺氧时间为24h,此时对HK-2细胞的活力影响较小,而且细胞中HIF-1α蛋白的表达量最多。构建理想的细胞缺氧模型为后续研究工作的开展提供了必要的基础。背景和目的基因沉默是广泛存在于生物界的古老现象,是生物体抵御病毒或其它外来核酸入侵以及保持自身遗传稳定的保护性机制,广泛存在于真核生物细胞中。RNA干扰(RNAi)作为一种新的基因沉默的方法,在基因功能的研究上呈现出巨大的应用前景。应用RNAi特异性地沉默基因来研究该基因的功能的方法已经被国内外学者广泛接受。RNAi具有高度特异性、高效性和安全性的特点,它可以在既不破坏基因结构又不引起基因突变的情况下,敲除某基因,以研究其功能。然而,不同的哺乳动物细胞的转染效率会有所差别,在实验中需要对每一种细胞系选择合适的转染试剂和最佳的转染条件。适量的转染试剂和siRNA的最佳终浓度对RNAi基因沉默的效率起着重要作用。本研究旨在评估转染试剂转染siGLO的效率和确定HIF-1αsiRNA沉默HIF-1α的最佳浓度。材料和方法RNAi的试剂主要包括SMARTpool HIF-1αsiRNA、siGLO siRNA阴性对照和DharmaFECT 1转染试剂,购自美国Dharmacon公司。转染方法按照公司提供的Protocol进行操作。应用激光共聚焦荧光显微镜观测转染效率；应用荧光定量PCR法进行定量分析细胞中HIF-1αmRNA的表达量。结果1)4μl转染试剂和终浓度100nM siGLO转染指示剂(即转染试剂与siGLO的比例为4μl:0.2nmol)转染细胞时可以获得95%-100%的转染效率。2)HIF-1αsiRNA终浓度分别为25、50和100nM时,HIF-1αsiRNA沉默HIF-1αmRNA的效率分别为24.0±8.6%、43.0±4.2%和70.0±4.2%。3)沉默HIF-1α的HK-2细胞经过缺氧处理后,其中HIF-1αmRNA的相对量是仅经过缺氧处理细胞中的3.3%,即在缺氧条件下HIF-1αsiRNA沉默HIF-1αmRNA的效率可达到96.7%。结论对于HK-2细胞,转染试剂与siRNA以(4μl：0.2nmol)比例混合、siRNA终浓度为100nM时,可以获得较高的转染效率和沉默效率。而且,基因沉默的效率不仅与合适的转染试剂、优化的转染条件等密切相关,同时还与目的基因的丰富程度密切相关。背景和目的缺氧不利于细胞的生长,但是细胞可能通过一系列的基因型和代谢的改变来维持生存,甚至增殖。在缺氧条件下机体或细胞会产生一系列的缺氧应答反应,而这些缺氧应答反应主要通过缺氧诱导因子(HIF)来调控。HIF作为氧自稳调节的关键性转录因子,能够调节百余种靶基因的表达,从而使得机体或细胞对缺氧缺血性损伤产生适应性反应。目前发现HIF家族共有3个成员,包括HIF-1、HIF-2和HIF-3,其中HIF-1广泛分布于哺乳动物和人体细胞内。在肾脏缺氧缺血损伤中,HIF-1主要表达在肾小管上皮细胞上。HIF-1是由α亚基和β亚基组成的一种异二聚体,其中α亚基是功能性亚基,p亚基是结构性亚基。缺氧缺血会诱导HIF-1表达的增加,HIF-1能启动下游基因表达上调,迄今发现的HIF-1的靶基因涉及到缺氧后机体反应的很多方面,包括葡萄糖转运、糖酵解、血管形成、细胞命运、红细胞再生、细胞外基质代谢和纤维化等等。有关HIF-1对缺氧缺血状态下的组织或细胞的影响的研究颇多,但结论不尽相同。有研究表明HIF-1可通过一些保护性基因如血管内皮生长因子(VEGF)、葡萄糖转运蛋白-1(Glut-1)、促红细胞生成素(EPO)和血红素加氧酶(HO-1)等对缺氧缺血状态下的组织或细胞产生保护作用,改善缺氧缺血性损伤后的能量代谢障碍,促进细胞存活和损伤的修复。也有研究显示相反的结果,HIF-1有促凋亡、加重肾脏损伤、促进肾脏纤维化的作用。HIF-1对缺氧状态下近曲肾小管上皮细胞生存的影响逐渐引起人们的关注。本研究旨在通过siRNA沉默HIF-1α基因来研究HIF-1α对缺氧状态下近曲肾小管上皮细胞生存的影响。材料和方法HK-2细胞随机分成5组：(1)正常培养组(Normoxia group),细胞不经过RNAi和缺氧处理,在正常培养条件下培养；(2)缺氧培养组(Hypoxia group),在正常培养后,细胞在含150μM CoCl2的培养液中孵育24h；(3)转染试剂组(Transfection group),细胞在RNAi时仅加入转染试剂,未予以siRNA,并经过缺氧处理；(4)阴性对照组(Negative group),细胞在RNAi时应用一个无任何靶基因的siRNA阴性对照,并经过缺氧处理；(5)HIF-1αsiRNA组(HIF-1αsiRNA group),细胞经过HIF-1αsiRNA沉默HIF-1α,并经过缺氧处理。应用MTT试验检测细胞的生长抑制率；应用流式细胞术(Annexin/PI双染法)、TUNEL细胞凋亡检测法和Western免疫印记定量Caspase-3蛋白量等3种方法检测细胞的凋亡情况；应用乳酸脱氢酶(LDH)检测法检测细胞坏死情况。结果1)缺氧培养组、转染试剂组、阴性对照组和HIF-1αsiRNA组细胞的生长抑制率分别为6.2±1.7%、8.1±2.0%、4.6±3.5%和22.1±1.2%。HIF-1αsiRNA组细胞的生长抑制率显著高于缺氧培养组、转染试剂组、阴性对照组细胞的生长抑制率(P<0.05),而后三组细胞的生长抑制率之间的差异无统计学意义(P>0.05)。2)流式细胞术检测细胞的凋亡率,依次为0.5±0.1%、2.8±0.8%、2.3±0.5%、3.0±0.1%和3.3±1.0%;TUNEL法检测细胞的凋亡指数,依次为2.8±0.6%、6.3±0.6%、5.8±0.6%、6.3±0.6%和7.1±0.4%。正常培养组细胞的凋亡率和凋亡指数显著低于其他四组(P<0.05),而其他四组间差异无统计学意义(P>0.05)；正常培养组细胞Caspase-3蛋白表达量显著低于其他四组(P<0.05),而其他四组间差异无统计学意义(P＞0.05)。3)各组细胞培养液中LDH浓度依次为516.7±23.6U／L、618.5±26.2U／L、618.8±46.8U／L、629.8±52.2U／L和822.6±62.3U／LHIF-1αsiRNA组细胞培养液中LDH浓度显著高于其他四组(P<0.05),而正常培养组则显著低于其他四组(P<0.05)。结论缺氧会引起HK-2细胞的凋亡和坏死；沉默HIF-1α基因能够明显地抑制缺氧状态下HK-2细胞的增殖,并加重其坏死,而对凋亡无明显影响。从反面论证了HIF-1α基因对缺氧状态下人近曲肾小管上皮细胞的保护作用。背景和目的缺氧可以调控人近曲肾小管上皮细胞的多种基因和基因家族的表达。HIF-1α是缺氧适应性反应的关键性的转录因子,它通过诱导下游的保护性基因的表达来保护缺血性肾损伤。迄今发现HIF-1的靶基因有百余种,其中有一些基因促进细胞的存活和缺氧后的恢复,比如细胞能量代谢和血管新生等方面。有研究表明,VEGF是HIF-1重要的靶基因,它能够抑制肾小管周围毛细血管内皮细胞凋亡,促进体外培养的肾小管上皮细胞存活,并且促进内皮细胞增殖、血管生成修复等,具有细胞保护作用。Glut是分布在细胞膜上的一类跨膜糖蛋白,是葡萄糖跨膜转运的载体,其中Glut-1分布最为广泛,是哺乳动物细胞转运葡萄糖跨过细胞膜进入细胞的主要载体,能促进葡萄糖向细胞内扩散,并促进细胞能量代谢。有研究表明,Glut-1的过表达有利于组织细胞对缺血缺氧的耐受性及组织细胞损伤的修复,并且能够使细胞在缺氧状态下维持生存。本研究通过观察Glut-1和VEGF等基因的表达情况来探讨HIF-1α对缺氧状态下近曲肾小管上皮细胞影响的可能的分子机制。材料和方法HK-2细胞随机分成5组：(1)正常培养组(Normoxia group),细胞不经过RNAi和缺氧处理,在正常培养条件下培养；(2)缺氧培养组(Hypoxia group),在正常培养后,细胞在含150μM COCl2的培养液中孵育24h；(3)转染试剂组(Transfection group),细胞在RNAi时仅加入转染试剂,未予以siRNA,并经过缺氧处理；(4)阴性对照组(Negative group),细胞在RNAi时应用一个无任何靶基因的siRNA阴性对照,并经过缺氧处理；(5)HIF-1αsiRNA组(HIF-1αsiRNA group),细胞经过HIF-1αsiRNA沉默HIF-1α,并经过缺氧处理。收集各组细胞,提取蛋白和RNA。应用荧光定量PCR法定量检测细胞中HIF-1α、HIF-2α、Glut-1、VEGF和β-actin mRNA的表达量；应用Western免疫印记法定量检测细胞中HIF-1α、HIF-2α、Glut-1、VEGF和Tubulin蛋白表达量。结果1)正常培养组和HIF-1αsiRNA组细胞的HIF-1α、Glut-1和VEGF mRNA的表达量显著低于其他三组(P<0.05)。正常培养组细胞中HIF-2αmRNA的表达量显著低于其他四组(P<0.05),而其他四组细胞中HIF-2αmRNA的表达量之间差异无统计学意义(P>0.05)。2)正常培养组和HIF-1αsiRNA组细胞的HIF-1α、Glut-1和VEGF蛋白的表达量显著低于其他三组(P<0.05)。正常培养组细胞中HIF-2α蛋白的表达量显著低于其他四组(P<0.05),而其他四组细胞中HIF-2α蛋白的表达量之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论HK-2细胞中Glut-1和VEGF的表达与HIF-1α的表达呈同步变化关系。HIF-1α对缺氧状态下HK-2细胞的保护作用可能是通过调控下游基因Glut-1和VEGF实现的,但可能还存在其他的机制,有待进一步深入研究。