【摘 要】
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中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）为我国重要的经济水生动物,近年来由于细菌病毒等的危害,给养殖业带来巨大损失,因此研究中华绒螯蟹免疫相关基因,对探索中华绒螯蟹疾病防治方法具有重要意义。Peroxiredoxin（Prx）为抗氧化蛋白超家族的一员,在于真核和原核生物中普遍存在,并于先天免疫中发挥着重要作用。本研究采用PCR等技术从中华绒螯蟹肝胰腺中克隆获得了EsPrx和EsPrx4的
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中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）为我国重要的经济水生动物,近年来由于细菌病毒等的危害,给养殖业带来巨大损失,因此研究中华绒螯蟹免疫相关基因,对探索中华绒螯蟹疾病防治方法具有重要意义。Peroxiredoxin（Prx）为抗氧化蛋白超家族的一员,在于真核和原核生物中普遍存在,并于先天免疫中发挥着重要作用。本研究采用PCR等技术从中华绒螯蟹肝胰腺中克隆获得了EsPrx和EsPrx4的cDNA序列,采用荧光定量PCR检测了EsPrx和EsPrx4基因在不同组织,鳗弧菌及铜离子刺激下的肝胰腺组织中的表达规律,以了解Prx基因在中华绒螯蟹中的作用,为更好的了解甲壳动物的固有免疫提供理论依据。同时筛选了3种不同情况下10个内参基因的稳定性,为进一步相关基因研究提供参考。主要研究结果如下:（1）中华绒螯蟹EsPrx和EsPrx4基因cDNA序列分析结果表明,EsPrx cDNA序列全长为1599 bp,开放阅读框（ORF）597 bp,编码198个氨基酸,5’部分非编码区（UTR）46 bp,3’非编码区956 bp,加尾信号（AATAAA）与poly（A）尾,推导出EsPrx蛋白的分子式C994H1544N258O293S8,分子量22.05k Da,理论等电点5.67,总平均亲水性为-0.193,可判断EsPrx蛋白为亲水性蛋白。EsPrx4cDNA序列全长为1463 bp,其中包含由119 bp组成的5’UTR,738 bp的ORF,编码245个氨基酸,以及一个606 bp的3’UTR,加尾信号（AATAAA）与poly（A）尾,推导出EsPrx4蛋白的分子式C1236H1902N326O358S8,预测分子量27.31k Da,理论等电点5.55,总平均亲水性-0.181,这些可判断EsPrx4蛋白为亲水性蛋白。同源性比对表明,相较于其他动物,EsPrx与EsPrx4氨基酸序列与虾蟹类的相似性和一致性更高,同时都含有保守序列“FYPLDFTFVCPTE”和“GEVCPA”。系统进化树结果显示中华绒螯蟹EsPrx与EsPrx4首先与甲壳动物聚集在一起,而后在与其他动物2-CysPrx聚集。（2）中华绒螯蟹内参基因的筛选通过对内参基因进行筛选,分析了10个候选内参基因（AK,UBE,GST,GAPDH,α-TUB,EF-1α,HSP90,β-ACTIN,EF-2和PGM2）在中华绒螯蟹不同组织,鳗弧菌和铜离子刺激下的表达。采用Ct值分析、ge Norm、Best Keeper、Norm Finder和Ref Finder（http://www.leonxie.com/referencegene.php）综合在线分析软件对10个内参基因的稳定性进行评价,筛选出稳定的内参基因。结果为:在不同组织中候选内参基因稳定性顺序由高到低为:EF-1α>EF-2>PGM2>UBE>GAPDH>HSP90>GST>α-TUB>β-actin>AK;鳗弧菌刺激下,候选内参基因稳定性顺序为:AK>EF-1α>α-TUB>GAPDH>UBE>β-ACTIN>EF-2>PGM2>GST>HSP90。铜离子刺激下候选内参基因稳定性顺序为:GAPDH>β-ACTIN>α-TUB>PGM2>EF-1α>EF-2>AK>GST>UBE>HSP90。（3）EsPrx和EsPrx4表达特征分析EsPrx和EsPrx4表达结果表明,EsPrx和EsPrx4在中华绒螯蟹不同组织中均有表达,且在肝胰腺中表达最高。鳗弧菌刺激后,EsPrx表达明显上升,24 h后表达量达到最高峰,且与对照组的差异极显著（p<0.01）,后恢复至正常水平;EsPrx4在6 h的表达量显著下降（p<0.01）,后逐渐上升,直至24 h表达量达到最高,最后恢复至正常水平。铜离子刺激下,EsPrx和EsPrx4都呈现不同的表达谱。研究表明EsPrx和EsPrx4都参与了鳗弧菌与铜离子刺激引起的反应。
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