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肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）是最常见的肝癌类型,约占原发性肝癌的85%以上。由于发病隐匿、术后易复发转移、缺乏高效化疗药物等原因,HCC严重威胁人类的生命和健康。因此,研究影响HCC发生发展的关键因素及其作用机制,对于发现HCC治疗新靶点分子、发展HCC治疗新药物、改善HCC患者预后具有重要意义。转录因子FOXA2（Forkhead boxprotein A2,FOXA2）,通过调控下游靶基因的转录表达,在肝脏代谢稳态的维持以及HCC的发生发展中发挥重要作用,但其具体机制尚需研究。磷酸化、乙酰化等蛋白质翻译后修饰是调控FOXA2转录活性的重要机制。O连接N-乙酰葡糖胺（O-linked N-acetylglucosamine,O-GlcNAc）糖基化是重要的蛋白质翻译后修饰形式之一,它是指以己糖胺合成途径（hexosamine biosynthetic pathway,HBP）的下游产物UDP-GlcNAc为糖基供体,由糖基转移酶催化细胞内可溶性蛋白质丝氨酸/苏氨酸残基羟基的O与GlcNAc共价连接,发生蛋白质可逆单糖修饰的过程。O-GlcNAc糖基化修饰通过影响基因表达及代谢等过程,在细胞环境胁迫应答中发挥作用。研究表明,在HCC进程中蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰水平出现异常上调。然而,这种O-GlcNAc修饰异常上调在HCC发生发展中的作用及其与FOXA2功能调控的关系,尚未见报道。本论文以人HCC细胞为对象,研究转录因子FOXA2和蛋白质的O-GlcNAc修饰对人HCC细胞生物学行为的影响,为HCC治疗药物的设计开发提供新靶点和策略。开展的主要研究如下:（1）FOXA2对HCC细胞蛋白O-GlcNAc修饰水平和功能的影响谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶（Glutamine-fructose-6-phosphate transaminase 1,GFPT1）是 HBP 途径的限速酶。利用报告基因和免疫印迹等分析发现,人HCC细胞FOXA2通过直接结合GFPT1的启动子区,在转录水平上调GFPT1的表达;串联质谱分析代谢物证实,FOXA2对GFPT1的转录激活能够增加HBP途径终产物UDP-GlcNAc的胞内积累,导致胞内O-GlcNAc糖供体增加,整体O-GlcNAc修饰水平因此而上调。进一步研究发现,在肿瘤化疗药物阿霉素诱导的人HCC细胞凋亡过程中,上调FOXA2表达,GFPT1转录及胞内蛋白O-GlcNAc糖基化水平表现同步增加,NF-κB和STAT3等抗凋亡因子发生高水平的O-GlcNAc糖基化修饰,进而导致HCC细胞出现凋亡抵抗现象。由此可见,FOXA2通过上调GFPT1转录,改变胞内蛋白O-GlcNAc修饰稳态影响HCC细胞的凋亡活性。（2）O-GlcNAc修饰对FOXA2功能的影响首先,利用O-GlcNAc糖基化特异性抗体和凝集素的印迹分析确证HCC细胞中FOXA2存在O-GlcNAc糖基化修饰。利用O-GlcNAc修饰抑制剂和激活剂处理改变FOXA2糖基化水平,发现O-GlcNAc修饰增加可降低FOXA2蛋白水平。进一步研究证实,O-GlcNAc修饰通过增强泛素-蛋白酶体途径介导FOXA2蛋白的降解,降低FOXA2蛋白稳定性,进而衰减FOXA2蛋白与上皮-间质转化关键靶基因E-cadherin启动子区的结合,抑制FOXA2对E-cadherin的转录激活作用。细胞迁移与侵袭能力分析表明,在人HCC细胞中O-GlcNAc修饰水平上调通过降低FOXA2蛋白水平,抑制E-cadherin转录,最终增强HCC细胞的转移潜能。由此可见,人HCC细胞中存在O-GlcNAc修饰对FOXA2功能的负调控过程。（3）特定氨基酸残基位点的O-GlcNAc修饰对FOXA2靶基因表达及其在HCC中作用的影响首先,EtHCD串联质谱分析鉴定发现427位丝氨酸（Ser427）为FOXA2蛋白的候选O-GlcNAc糖基化修饰位点。随后在HCC细胞中,结合O-GlcNAc特异性抗体和凝集素印迹分析Ser427位点突变后FOXA2的糖基化修饰水平,确证发现Ser427为FOXA2的主要O-GlcNAc糖基化位点。进一步,利用蛋白质组学、染色质免疫共沉淀-高通量测序（ChIP-seq）与转录组学（RNA-seq）等多组学策略,比较FOXA2的Ser427糖基化位点突变前后的HCC细胞,全景式挖掘分析O-GlcNAc糖基化对FOXA2与其他转录调控蛋白相互作用的影响、对FOXA2在全基因组范围内与染色质和靶基因结合的调控、对FOXA2转录调控功能及靶基因表达的影响。整合多组学结果揭示:Ser427位O-GlcNAc修饰可通过调控FOXA2和NCOA7、TLE5、FOXK1等转录调控蛋白的相互作用,改变FOXA2在染色质上的定位和互作强度,进而影响其与包括SATB1、CDH6和IL6在内的30个靶基因的结合并调控其转录活性,导致包括细胞凋亡、转移在内的多种生理和病理过程相关通路基因表达发生变化,最终导致人HCC细胞多种细胞生物学行为异常。以上结果揭示,O-GlcNAc修饰影响转录因子FOXA2对靶基因表达的调控及其在人HCC细胞中功能作用的发挥;转录因子FOXA2和O-GlcNAc修饰之间存在着相互调节,二者相互调节及稳态水平的失衡,可能是HCC发生发展的新机制;FOXA2及其O-GlcNAc糖基化修饰可能是治疗HCC药物的新靶点分子。