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南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)由介体白背飞虱传播,不经卵传播。SRBSDV编码的非结构蛋白P5-1、P6和P9-1是病毒复制和装配的场所—病毒原质(viroplasm)的组分。这三种非结构蛋白在病毒的复制过程中扮演着至关重要的作用。已知P6能分别与P5-1和P9-1互作,而P5-1和P9-1不能互作,那么这三种非结构蛋白在病毒原质的形成过程中是否由某一个蛋白起着决定性的作用,需要我们深入的研究。本实验首先通过免疫荧光标记技术在介体白背飞虱培养细胞中观察SRBSDV侵染后P5-1、P6和P9-1表达的先后顺序,结果发现当SRBSDV侵染18 h时,P9-1没有表达,P6的表达量稍多于P5-1,且以颗粒状形态分布在细胞质周围;36 h时,P5-1和P6都大量表达,而此时P9-1也开始少量表达;随着侵染时间的延长,P5-1,P6和P9-1的表达量都显著升高;72h时,三种非结构蛋白均匀分布在细胞质中。所以这三种蛋白表达的先后顺序为P6,P5-1和P9-1。其次,利用RNAi(RNAinterference)干扰和免疫荧光标记技术研究发现,分别干扰P5-1、P6和P9-1在白背飞虱培养细胞中的表达,均导致SRBSDV的侵染率显著降低。同时,抑制P5-1表达后,P5-1和P9-1的表达量明显降低,但是P6的表达量和对照组相当;抑制P6表达后,P5-1、P6和P9-1的表达量都显著降低;抑制P9-1表达后,除了自身蛋白的表达量降低外,另外两个蛋白的表达水平不受影响。dsRNAs降低了目标蛋白的转录和表达水平,并且干扰P6的表达对病毒复制的影响最大。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot的实验结果也进一步证实了这一结论。最后,我们构建目的基因N端融合e-GFP或mCherry的重组杆状病毒表达载体,当SRBSDV P5-1-eGFP、P6-mCherry和P9-1-mCherry在Sf9细胞中单独表达时,P5-1-eGFP弥散分布在细胞质周围,P6-mCherry和P9-1-mCherry都以颗粒状分布在细胞质内。当三种蛋白两两组合共同侵染时,P6-mCherry与P5-1-eGFP和P9-1-eGFP都会共定位,形成颗粒状的病毒原质,而这和实验室构建的杆状病毒表达载体Bacmid-SRBSDV-P5-1、P6和P9-1侵染Sf9细胞的结果是一致的。这一结果也进一步说明P6在SRBSDV病毒原质的形成过程中起到了其他蛋白无法代替的作用。综合以上结果,本实验在细胞水平,通过观察三种非结构蛋白在介体细胞中的表达顺序,明确当SRBSDV侵染介体白背飞虱细胞后,P6最早表达,可能起重要的调控作用。借助于dsRNA诱导的RNAi、RT-qPCR和Western blot等技术手段证实了 P6是病毒复制增殖过程中最关键的因子,启动病毒原质的形成,P6能够招募P5-1和P9-1 一起形成病毒原质,P5-1和P9-1在病毒原质中参与病毒基因组的复制和病毒粒体的装配。因此,通过对P6的深入研究,有助于我们利用靶标基因找到防治水稻病毒病的方法,为生物防治提供思路。