论文部分内容阅读
目的缺血性心脏病目前是我国致残率和致死率最高的疾病之一,而尽早恢复缺血心肌血流再灌注是其主要治疗手段。缺血心肌获得再灌注之后,会生成大量氧自由基、Ca2+以及炎症因子等伤害性物质,进一步加重原有的心肌损伤。瞬时电位香草酸亚型1受体（Transient Receptor Potential Vanilloid 1,TRPV1）,在心脏感觉传入神经元上大量表达,且能够被心肌缺血过程中局部产生的物质刺激活化。背根神经节（Dorsal Root Ganglia,DRG）作为害性刺激信号传导的中间站,可将其传至相应节段脊髓背角,最终传至中枢和大脑皮层。神经生长因子（Nerve growth factor,NGF）除具有维持感觉神经和交感神经生长发育及功能的作用外,还可在一定程度上增强初级传入神经元感受伤害性刺激信号的敏感性,所以我们认为在感觉神经元受到伤害性刺激活化的过程中,NGF发挥重要作用。心肌缺血再灌注（Ischemia reperfusion,IR）时,NGF参与了心肌缺血后神经应激反应。前期研究发现,发现鞘内吗啡预处理（Intrathecal morphine preconditioning,ITMP）可通过中枢神经系统减少心肌IR损伤,但对于NGF在IR心肌损伤和鞘内吗啡诱导的心脏保护作用中的意义却知之甚少。本研究通过特异性沉默或过表达脊髓NGF基因,探讨鞘内吗啡预处理发挥心肌保护作用与脊髓内NGF表达的关系及机制。方法设计合成NGF,构建NGF过表达的慢病毒（Lentivirus,LV）载体:LV-NGF;3条针对靶基因NGF的短发卡RNA（Short hairpin RNA,shRNA）,包装NGF沉默表达的慢病毒载体,分别记为LV-NGF shRNA1,LV-NGF shRNA2,LV-NGF shRNA3。在动物水平（SD大鼠）验证NGF过表达效率以及筛选验证NGF shRNA的基因沉默效率并选择沉默效率最佳的NGF shRNA。观察慢病毒对脊髓组织的感染情况,并分别检测脊髓组织NGF mRNA水平和NGF蛋白表达。雄性SD大鼠48只,260±20 g,建立鞘内置管模型。实验分组,本实验分成两个部分进行研究。第一部分:脊髓NGF基因过表达对鞘内吗啡预处理心肌保护作用的影响。将鞘内置管成功的大鼠随机分为6组（n=6）,分别为:假手术对照组（Sham）,心肌缺血再灌注组（I/R）,鞘内吗啡预处理组（ITMP+I/R）,NGF基因过表达及心肌缺血再灌注组（LV-NGF+I/R）,NGF基因过表达及鞘内吗啡预处理组（LV-NGF+ITMP+I/R）,空白过表达及鞘内吗啡预处理对照组[LV-CON（NGF）+ITMP+I/R]。第二部分:脊髓NGF基因沉默对鞘内吗啡预处理心肌保护作用的影响。鞘内置管成功的大鼠随机分为5组（n=6）,分别为:Sham组,I/R组,ITMP+I/R组,NGF基因表达沉默及鞘内吗啡预处理组（LV-NGF shRNA+ITMP+I/R）,空白沉默及鞘内吗啡预处理对照组[LV-CON（NGF shRNA）+ITMP+I/R]。除Sham组之外,其余各组均结扎冠状动脉左前降支30 min,解开线结再灌注120 min,制备大鼠心肌缺血再灌注模型。期间监测心电图,计数心律失常次数和持续时间。再灌注120 min结束时取心脏,测定心肌梗死区（Infarct size,IS）与缺血危险区（Area at risk,ARR）的体积,进而计算AAR/（LV+RV）以及IS/ARR的比值;留取动脉血,测定血清肌钙蛋白I（c Tn I）表达水平;取脊髓T2-6节段,荧光定量PCR检测NGF和TRPV1 mRNA表达水平;Western Blot检测脊髓和DRG内NGF及其受体酪氨酸激酶A（Tyrosine kinase A,Trka）、TRPV1和磷酸化TRPV1（p-TRPV1）蛋白的表达;免疫荧光检测脊髓背角P物质（Substance P,SP）和降钙素基因相关肽（Calcitonin gene-related peptide,CGRP）的共表达。结果1.在体动物水平验证大鼠脊髓内NGF基因过表达效率和NGF shRNA沉默效率以及筛选抑制效率最高的NGF shRNA。荧光显微镜观察脊髓切片,鞘内注射慢病毒可成功感染大鼠T2-6胸段脊髓;LV-NGF的基因过表达效果明显,与Sham组相比,NGF mRNA和蛋白表达水平明显升高;LV-NGF sh NGF3的基因沉默效果最好,与Sham组相比,NGF mRNA和蛋白表达水平明显下降。说明LV-NGF和LV-NGF shRNA3可使大鼠脊髓组织中NGF基因过表达或抑制。2.脊髓NGF基因过表达可减轻鞘内吗啡预处理的心肌保护作用。与I/R组相比,ITMP+I/R组心肌梗死面积显著减少,但预先鞘内注射LV-NGF,可增大心肌梗死面积;脊髓和DRG中NGF/Trka蛋白表达增多,说明脊髓NGF基因过表达可减轻吗啡的心肌保护作用。3.脊髓NGF基因沉默可增强鞘内吗啡预处理的心肌保护作用。鞘内注射LV-NGF shRNA,可减少心肌梗死面积;脊髓和DRG中NGF/Trka蛋白表达减少,说明脊髓NGF基因抑制可增强吗啡的心肌保护作用。4.脊髓NGF诱导的TRPVI调节和神经递质释放。与I/R组相比,ITMP组脊髓和DRG中TRPV1/p-TRPV1蛋白的表达水平下降。与ITMP相比,LV-NGF+ITMP+I/R组脊髓和DRG中TRPV1/p-TRPV1蛋白的表达显著提高,LV-NGF shRNA+ITMP+I/R组脊髓和DRG中TRPV1/p-TRPV1蛋白的表达显著下降。免疫荧光染色结果显示,鞘内注射吗啡后脊髓背角SP和CGRP的表达明显减少;脊髓NGF基因过表达显著增强了脊髓背角内的SP和CGRP的表达;相反地,脊髓NGF基因沉默明显减少了脊髓背角内的SP和CGRP的表达。结论鞘内吗啡预处理的心肌保护作用可能通过介导脊髓内NGF的表达而实现,其机制可能与NGF敏化TRPV1有关。