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背景与目的:羊膜是一种来源方便、取材容易和价格便宜的生物材料,单纯的人羊膜抗原性极低,羊膜移植已成为当今眼表手术的一个热点。其临床主要作用:①加速上皮化;②维持正常上皮表型,减轻炎症反应;③减轻血管化,减少瘢痕形成等以及可能的作用机制也逐渐被人们研究和认识。羊水的抗菌特性曾被很好的证实,但关于羊膜是否具有抗菌特性却少有文献报道,且研究结果不一致。抗菌肽(Antimicrobial Peptides,AMPs)是生物防御系统产生的一类对抗外源性病原体的小分子肽类物质,是天然免疫的重要防御物质。抗菌肽分布极为广泛,几乎在所有的生物种属中均有发现。自上世纪80年代初被首次发现到现在,已经分离出千余种抗菌肽。人源性抗菌肽主要由防御素(human beta defensin,HBD)、cathecidins和histatin三类组成,主要存在于中性粒细胞及皮肤和粘膜的上皮细胞。由于传统抗生素的耐药性问题日趋严重,抗菌肽的药用开发已成为研究热点。2007年King等报道在人胎盘、胎膜和胎盘的绒毛膜滋养层以及羊膜上皮和蜕膜上都有HBD1-3的表达,同时还发现在体外培养的初级滋养层细胞中,HBD2的mRNA表达会随炎症细胞因子IL-1β的诱导而上调。2007年Stock等也证实原代培养的羊膜上皮细胞中存在着HBD1-3的mRNA和蛋白的表达,在10ng/ml的IL-1β诱导刺激后,HBD2 mRNA的增长呈双峰,其中6 h和12 h时分别增长了51倍和67倍,HBD2蛋白的生成在24 h后明显增加。作者认为羊膜生成较强有力的自然抗菌物质可能在防止妊娠感染中发挥重要作用,其中HBD2会随妊娠相关的炎症细胞因子IL-1β的诱导而大量上调。基于上述研究结果,我们认为人羊膜作为生物材料除了具有目前所公认的一些临床作用以外,还应该具有较强的抵抗病原微生物的作用。本实验拟对人羊膜匀浆上清液(human amniotic homogenate supernatant , HAHS)的抗菌特性进行研究,以期对临床羊膜移植手术的移植材料、手术适应证的选择有所指导,探索一种新的治疗眼表感染性疾病的方便有效的手段。方法:1.按照文献报道的方法和纳入标准从健康产妇的胎盘组织获取新鲜羊膜,并制备‘去上皮’羊膜。以金黄色葡萄球菌ATCC25923为测试菌,应用琼脂糖扩散法测定新鲜人羊膜和‘去上皮’羊膜在上皮面向上或是向下时是否都具有体外抗菌活性。2.制备新鲜HAHS,BCA法测定蛋白含量,以经鉴定培养的3个标准菌株、4个临床分离敏感菌株、4个临床分离多重耐药菌株以及3个临床分离真菌菌株为测试菌,采用琼脂糖扩散法测定新鲜HAHS的抗菌谱。3.以金黄色葡萄球菌ATCC25923和大肠杆菌ATCC25922作为测试菌,采用微量肉汤稀释法和菌落计数法分别测定新鲜HAHS对上述2种待测菌的最小抑菌浓度MIC(minimal inhibitory concentration)和最小杀菌浓度MBC(minimal bactericidal concentration),与眼科临床常用的10种抗生素比较抗菌作用强弱。4.以金黄色葡萄球菌ATCC25923为测试菌,通过比较等量的待测菌液,与不同水平影响因素作用后的等量的HAHS,反应1 h后吸光度值D(600)下降的幅度大小[△D(600)],研究温度、pH值及保存时间对HAHS抗菌活性的影响。5.制作电镜标本,透射电镜下观察HAHS抗菌作用的可能靶点。结果:1、“去上皮”羊膜以两种方向贴附于培养基均无抑菌环产生,边缘有菌落长入覆盖羊膜,HE染色切片证实羊膜上皮细胞刮除完全;而新鲜人羊膜以两种方向贴附均有明显的抑菌环出现,HE染色证实其单层立方上皮细胞完整。2、HAHS对本实验选用的3个标准菌株,4个临床分离敏感菌株,3个临床分离真菌菌株及粪肠球菌临床多重耐药株共11种菌株均有明显抑菌作用,抑菌环明显。而对阴沟杆菌、大肠杆菌和MRSA的临床多重耐药菌株均无明显的抑菌作用。3、以物质的量浓度计,金葡菌ATCC25923组:HAHS的MIC值明显小于氯霉素,与克林霉素相当,大于青霉素、利福平和左氧氟沙星,MBC值不大于5种中任何一种抗生素;大肠杆菌ATCC25922组:HAHS的MIC值小于磺胺醋酰钠和头孢呋辛钠,与妥布霉素相当,大于庆大霉素和诺氟沙星,MBC值也不大于5种中任何一种抗生素。4、以金葡菌ATCC25923为测试菌,在5.0,6.0,7.0,8.0和9.0五个不同pH值条件下,HAHS都具有良好的抗菌作用,各组间抗菌活性未见显著差异;经-20℃,4℃,20℃,37℃及60℃五个不同温度处理后的新鲜HAHS也保持了良好的抗菌作用,各组的抗菌活性无显著差异,而经过80℃处理的新鲜HAHS的抗菌活性较其它各个温度有明显的降低(△D(600)=0.00152,P<0.05),但仍表现出一定的抗菌作用;我们还分别观察了在4℃和20℃下将新鲜HAHS保存1 d,3 d,7 d,14 d,28 d,56 d后其抗菌活性的变化,结果证实,在两种保存温度下,随着保存时间的延长,HAHS的抗菌活性没有明显变化,保存56 d后(4℃和20℃的△D(600)分别为0.00297和0.00281),其对金葡菌ATCC25923仍有良好的抗菌作用。5、透射电镜观察发现:对照组大肠杆菌菌体完整、饱满,表面光滑平直,常见分裂现象;经新鲜HAHS作用1 h后的大肠杆菌,细菌干瘪皱缩,粗细不一,长短各异。表面粗糙不平,很难看到分裂相。一端膨大呈棒槌样,胞膜破裂,表面有明显孔洞,细胞内容物外溢。对照组金黄色葡萄球菌为球型,饱满,胞壁胞膜完整,分裂增殖活跃;经新鲜HAHS作用1h后,实验组金黄色葡萄球菌形态不规则,表面粗糙不平,几乎找不到分裂相。胞壁、胞膜上受到严重破坏形成明显孔洞,原生质扩散流出。结论:1、新鲜羊膜及其匀浆上清液具有明确的抗菌作用,‘去上皮’羊膜无抗菌作用,说明羊膜中抗菌活性物质存在于羊膜上皮细胞内。故临床眼表重建手术应尽量采用带上皮的新鲜羊膜。2、HAHS的抗菌谱较广,对于眼部感染常见的G+、G-、真菌甚至多重耐药菌株均有明显的抗菌作用。3、HAHS的抗菌活性明显强于氯霉素和磺胺,与克林霉素、头孢呋辛钠和妥布霉素相当,稍弱于其它5种抗生素;但其杀菌效能却不亚于10种抗生素中的任何一种。HAHS的MBC=MIC,而抗生素的MBC>MIC,说明HAHS的抗菌作用就是直接的杀菌作用。4、HAHS的理化性质十分稳定,易于保存,具备临床应用的条件,可能成为治疗眼表各类感染性疾病的一种便捷有效的方法。5、HAHS的抗菌作用靶点可能为细菌的质膜。