背景:2011年11月国际糖尿病联盟(IDF)公布的数据显示,中国糖尿病患者已超过9000万,位居世界第一,预计到2030年患病人数将增至1.3亿[1]。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)作为糖尿病独立的并发症目前已被肯定,并逐渐被流行病学专家和临床医生所重视。目前认为糖尿病心肌病导致细胞凋亡的发生主要与以下机制有关:(1)心肌能量代谢异常,主要是心肌对糖脂利用异常,表现为心肌对脂肪的利用增加,对糖的利用减少。(2)细胞内钙调控异常。(3)微血管病变和微循环障碍。(4)高血糖时氧化应激增加,信号转导途径改变,激活细胞程序化死亡[2]。尽管糖尿病心肌病的发病机制尚未明确,但氧化应激在糖尿病心肌病发生及发展中的地位和作用,已被大家所肯定[3]。高血糖所诱导的氧化应激是启动并贯穿糖尿病心肌病整个阶段,也是引起心肌细胞凋亡和坏死的重要损伤因素[4]。G蛋白偶联胆汁酸受体1(G protein-coupled bile acid receptor 1,TGR5)是一种特殊的胆汁酸膜受体,在胆汁酸信号网中起着重要作用。近年来的研究证实,它的激活可以改善机体能量代谢,减轻氧化应激及炎症反应[5]。因此TGR5可能成为治疗糖尿病心肌病的新靶点。已有研究证实TGR5广泛表达于多种组织中,如棕色脂肪组织,肝脏,肌肉和中枢神经系统等,但表达水平在各种组织中有明显差异,其最高表达在胆囊,心肌细胞上也有表达[6]。本课题以乳小鼠心肌细胞为研究对象,运用现代分子生物学技术,探讨在高糖环境下,激动心肌细胞膜上的TGR5受体后,对心肌细胞凋亡的影响,并研究其可能的机制。目的:本实验以乳小鼠心肌细胞为研究对象,探讨激动心肌细胞细胞膜上TGR5受体,能否减轻高糖对心肌细胞的损害及其可能的机制,从而丰富糖尿病心肌病的理论基础及探索新的治疗思路。方法:1.乳小鼠心肌细胞的原代培养。无菌条件下取得乳小鼠心脏,清洗后加入胰酶4°C过夜,次日终止消化,再用配制的胶原消化液分次消化得到单个心肌细胞,收集细胞接种于培养皿内,差时贴壁法除去心肌成纤维细胞,得到纯度相对较高的心肌细胞用于本实验。2.高糖致心肌凋亡模型的建立。心肌细胞在对照组血糖浓度(5.5mmol/L)培养基中培养2-3天后,选取贴壁细胞密度在90%以上,搏动节律于120-140次/min的心肌细胞用于实验。用高糖(40mmol/L)培养基干预心肌细胞72 h后,运用流式细胞仪技术检测心肌细胞与正常组的凋亡差异是否具有统计学意义。3.实时定量PCR检测心肌细胞膜上TGR5 m RNA及HO-1 m RNA的表达按照实验设计,不同组心肌细胞干预好后,分别提取各组心肌细胞RNA,通过对RNA的浓度及纯度鉴定好后,进行c DNA的反转录合成,从Gene Bank中查阅目的基因的序列号,运用计算机软件Primer Premier 5.0设计相应引物,上机进行目的基因的荧光定量检测。4.运用Western blot方法检测心肌细胞膜上TGR5蛋白的表达。按照实验设计分好组,用不同的干预处理心肌细胞后,裂解细胞,分别提取各组细胞膜蛋白,运用BCA方法测定得到的蛋白浓度,以Tubulin为内参,将处理好的蛋白质样品进行分离、转膜、封闭,依次孵育一抗和二抗、显色、成像后,将获得图像用图像处理软件Quantity One测定并分析条带灰度值以检测目的基因蛋白的表达水平。5.sh RNA沉默心肌细胞膜上TGR5基因细胞浓度约2×l07/孔,分别接种于六孔板内,正常培养3天,当贴璧细胞达到90%,取状态良好的细胞进行实验。Polybrene转染剂按照5μg/m L浓度与高糖+激动剂培养基混匀,室温孵育15min,取sh RNA稀释液20μl液加入培养孔混匀,再加入转染培养基。转染细胞72 h后提取需要的RNA,通过实时定量PCR检测TGR5的表达及流式细胞仪测量细胞凋亡。6.流式细胞仪测量心肌细胞总凋亡率按照实验设计的分组处理各组心肌细胞72 h后,用0.25%的胰酶(不含EDTA)消化成单个细胞并收集,用FITC Annexin V/Propidium Iodide分别进行染色,室温避光、反应15min,再加入Binding Buffer,混匀后行流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:1.乳小鼠心肌细胞原代培养成功。2.高糖致乳小鼠心肌细胞凋亡模型建立成功。3.实时定量PCR结果:3.1 TGR5 m RNA在不同组中表达:对照组、高糖和高糖加入激动剂组中表达量依次升高,各组间比较P值均<0.01;与对照组相比,低糖高渗组表达稍低,P>0.05;与对照组相比,肝组织组表达量明显升高,P<0.01;与高糖+激动剂相比,高糖+激动剂+病毒组表达量明显降低,P<0.01。3.2 HO-1 m RNA在不同组的表达:对照组、高糖组、高糖+TGR5激动剂(Nomilin)组,表达依次升高,各组间P值均<0.01。4.Western blot法检测各组细胞中TGR5蛋白的表达,分析并测量目的条带的光密度值。与对照组相比,高糖组TGR5表达量更高,P<0.05;与高糖组相比,高糖组+激动剂组TGR5表达量明显升高,P<0.01。5.sh RNA感染心肌细胞成功。6.流式细胞仪检测心肌细胞凋亡结果各组心肌细胞的总凋亡率(分早、晚期)通过流式细胞仪测量,进行统计分析各组中的差异。高糖组比对照组细胞凋亡更多,P<0.01;高糖+激动剂(Nomilin)组比高糖组凋亡明显减少,P<0.01;高糖+激动剂(Nomilin)+病毒组比高糖+激动剂(Nomilin)组凋亡明显增多,P<0.01;高糖+激动剂(Nomilin)+Zn PP组比高糖+激动剂(Nomilin)组凋亡明显增多,P<0.01。结论:1.高糖能上调小鼠心肌细胞上TGR5的m RNA及蛋白表达。2.激动TGR5能减轻乳小鼠心肌细胞在高糖环境中的凋亡,其机制可能与提高细胞内HO-1水平,从而保护心肌细胞有关。