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节瓜(BenincasahispidaCogn.var.Chieh-qua),是我国的特产蔬菜之一。枯萎病是节瓜主要病害之一,给生产造成了严重损失,因此抗病育种势在必行。本试验以黄毛节、黑毛节、七星节以及雌性系材料等为试材,在建立和完善节瓜离体培养体系的同时,初步建立了节瓜的抗枯萎病离体筛选体系;探讨了利用诱变剂EMS、NaN3和筛选剂FA、枯萎病毒素、HYP等进行抗枯萎病变异体筛选的可能性。初步确认了适宜的筛选方法和剂量,并对抗性细胞系及其再生植株的相关生理生化指标进行了研究。主要研究结果如下:
1.最佳的节瓜种子无菌萌发过程:将种子剥壳后,75%乙醇处理30s,然后无菌水冲洗3次,接着用0.1%HgCl2处理7min,无菌水冲洗5~8次(不少于10min),接种于1/2MS液体纸桥培养基上。暗培养3d后转入光照条件下培养(12h/d),可提高种子的萌发率,获得长势整齐,植株健壮的无菌苗材料。同时试验中也发现,不同基因型的节瓜种子在相同条件下的萌发率以及无菌苗的生长情况存在着一定的差异。相同的节瓜种子在不同的培养基上也存在类似的差异。
2.诱导节瓜不定芽最适外植体为茎尖。适宜的培养基为添加了0.2mg/LIAA和4mg/L6-BA的MS培养基;添加0.05mg/LTDZ的MS培养基;添加8mg/LZT和0.1mg/LIAA的MS培养基。子叶在添加了0.2mg/LIAA和4mg/L6-BA的MS培养基中也可以诱导形成芽,但频率很低,仅有2.5%。
3.利用EMS、NaN3为诱变剂,以节瓜萌发的种子为筛选材料,进行了节瓜离体诱变技术的研究,初步试验结果表明,适宜的EMS诱变条件为0.5%,1.5h;NaN3诱变的适宜条件为1.00%-2.00%,1h。
4.利用镰刀菌酸(FA)为胁迫剂,以节瓜不定芽为筛选材料,进行了节瓜抗枯萎病变异体离体筛选技术的研究,初步试验结果表明,FA胁迫的适宜浓度为80mg/L。经过筛选的细胞系对FA的抗性较未经筛选的细胞系明显增强。
5.利用羟脯氨酸(HYP)为胁迫剂,以节瓜不定芽为筛选材料,进行了节瓜抗性变异体离体筛选技术的研究,初步试验结果表明,HYP胁迫的适宜浓度为600mg/L。经过筛选的细胞系对HYP的抗性较未经筛选的细胞系明显增强。
6.利用FA为胁迫剂,以节瓜抗HYP不定芽为筛选材料,进行了节瓜抗枯萎病变异体离体筛选技术的研究,初步试验结果表明,以HYP600mg/L胁迫筛选出的抗性细胞系不定芽,恢复1代后接种于不同浓度的FA,其黄化指数明显高于同源的未经HYP筛选的不定芽,说明节瓜对HYP的抗性与对FA抗性可能不相关。
7.经过筛选获得的抗性不定芽以及移栽于大田的再生植株在正常生长情况下,其叶绿素含量、CAT活性、POD活性、可溶性蛋白含量、丙二醛(MDA)含量、SOD活性、游离脯氨酸含量等对比原始材料均有一定变化,且与抗病材料接近,而β-葡聚糖酶活性、几丁质酶活性则未发现明显变化。