研究背景与目的在二十世纪,人们普遍认为哮喘与过敏和嗜酸性粒细胞的气道浸润有关,过敏性哮喘是最常见和最具特征的类型。当时的研究主要集中在减少嗜酸性粒细胞浸润和控制伴随的Th2炎症的治疗方案上。因此,类固醇治疗是实现这一目标的最佳方法,成为哮喘治疗的基石。尽管目前大部分哮喘患者经皮质类固醇治疗后都能够有效地缓解症状,然而,有5-10%的哮喘患者对类固醇治疗的反应很差。这部分哮喘患者常常需要住院治疗,给医疗保健系统带来了沉重的经济负担。引起哮喘加重的因素包括屋尘螨(HDM)、花粉、呼吸道感染、香烟烟雾和空气污染物等。越来越多的证据表明,先天免疫反应与肺中潜在的Ⅱ型免疫微环境之间的相互作用改变了炎症的结局,并诱发了哮喘恶化。来源于HDM的蛋白酶通过促进异常的先天性和适应性免疫反应而促进哮喘的发病。脂多糖(LPS)通常来源于革兰氏阴性细菌的细胞壁和环境污染物。LPS的水平与哮喘的严重程度和肺功能的下降直接相关。此外,过敏性哮喘和哮喘加重的临床研究和实验模型表明,LPS与过敏原一起可能在疾病加重、糖皮质激素敏感表型向糖皮质激素抵抗表型转化中发挥重要作用。值得注意的是,中性粒细胞招募是那些对糖皮质激素治疗反应不佳的患者急性加重的突出特征之一。中性粒细胞向气道的浸润表明,宿主的天然免疫防御途径被激活以抵御感染。虽然有几条证据表明呼吸道感染和过敏原暴露促进哮喘恶化的发展,但哮喘恶化过程中中性粒细胞浸润、糖皮质激素抵抗与气道阻塞的发病机制之间错综复杂的分子网络尚不清楚。近年来,针对哮喘的免疫疗法大大改善了治疗策略,但其疗效在不同亚型哮喘患者中并不一致。其中重要的是确定特定的生物标志物和分子网络,这样不仅可以预测治疗结果,而且可以阐明宿主免疫细胞之间复杂的相互作用。单细胞RNA深度测序(scRNA Seq)最近被应用于了解异质细胞的发育和相互作用,并在全基因组范围内检测大量基因和转录亚型的表达。这使我们能够利用前所未有的详细信息来研究慢性疾病高度复杂的病理机制。强烈的气道高反应性(AHR)和炎症是哮喘的标志,通常反映疾病恶化的程度。LPS暴露与疾病的严重程度和类固醇抵抗有关。为了探讨哮喘加重的机制,我们在屋尘螨(HDM)诱导过敏性气道炎症的背景下建立了 LPS诱导的小鼠类固醇抗性哮喘加重模型。为了揭示哮喘恶化的复杂性,我们使用单细胞RNA深度测序来分析哮喘恶化过程中肺内的免疫细胞,并检查地塞米松治疗的效果。实验方法选用6-8周的BALB/c雄性小鼠,随机分为生理盐水对照组、HDM+LPS组、HDM+LPS+DEX 组、HDM 组、LPS 组、HDM+DEX 组。使用 HDM 溶液构建过敏性气道炎症模型,LPS溶液滴鼻诱导疾病加重,腹腔注射DEX溶液进行治疗。使用Flexivent装置检测小鼠对乙酰甲胆碱的气道阻力以评估小鼠的肺功能;肺功能检测完之后,收集小鼠的支气管肺泡灌洗液即BALF,通过计数BALF中不同种类的细胞来评估小鼠的炎症情况;获取左叶肺组织制作病理组织切片,HE&PAS染色后对样本粘液产生细胞、嗜酸性粒细胞进行定量并进行炎症评分。接着选择SAL组(生理盐水对照组)、VEH组(HDM+LPS)和DEX组(HDM+LPS+DEX),利用流式细胞术分选出小鼠肺组织中的免疫细胞进行单细胞测序,最后对测序的结果进行生物信息学分析。实验结果1 HDM和LPS暴露后诱导的哮喘加重对类固醇耐药VEH组相较于SAL组气道高反应性明显增加(p<0.01);BALF中的嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和总细胞数均明显增多(p<0.01),而巨噬细胞的数目在三组之间没有明显差异;粘液产生细胞和嗜酸性粒细胞的数目及炎症评分均明显高于SAL组(p<0.01)。DEX组相较于VEH组气道高反应性水平相当;BALF中的嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和总细胞数并没有减少;两组组织病理情况也没有明显差异。2 HDM和LPS的联合暴露相对于单独暴露于HDM或LPS具有更严重的AHR和气道炎症HDM组相较于SAL组气道高反应性增加(p<0.01);BALF中的嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和总细胞数均明显增多(p<0.01),而巨噬细胞的数目在四个组之间没有明显差异;粘液产生细胞和嗜酸性粒细胞的数目及炎症评分均明显高于SAL组(p<0.01)。HDM+LPS组相较于HDM组气道高反应性增加(p<0.01);BALF中的嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和淋巴细胞数明显增加(p<0.01);粘液产生细胞的数目和炎症评分明显高于HDM组(p<0.01)。3 地塞米松可减轻由HDM引起的AHR和气道炎症HDM组相较于SAL组气道高反应性增加(p<0.01);BALF中的嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和总细胞数均明显增多(p<0.01),而巨噬细胞的数目在三组之间没有明显差异;粘液产生细胞和嗜酸性粒细胞的数目及炎症评分均明显高于SAL组(p<0.01)。HDM+DEX组相较于HDM组气道高反应性水平下降(p<0.01);BALF中的嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和总细胞数明显减少(p<0.01);粘液产生细胞和嗜酸性粒细胞的数目及炎症评分明显低于HDM组(p<0.01)。4 肺免疫细胞的scRNA Seq分析识别出多个免疫细胞亚群小鼠肺组织的CD45+免疫细胞经单细胞测序后显示可分为20个主要的细胞群,包括T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、NK细胞、树突状细胞的亚群以及中性粒细胞和嗜碱性粒细胞。一些种类的细胞的数量在SAL组、VEH组和DEX组之间有较为明显的差异。5 中性粒细胞、单核细胞、CD11b-巨噬细胞和NK细胞可能与类固醇抵抗的严重哮喘有关采用加权基因共表达网络分析(WGCNA)来评估多个细胞群之间的基因相互作用,将不同的表达转录本分成了 6个基因共表达模块。采用无监督层次聚类对样本进行聚类分析。黑色模块出现在T细胞群中,蓝色模块出现在NK细胞群中,棕色模块出现在B细胞群中,红色模块主要在CD11b-巨噬细胞群中表达,在CD11b+巨噬细胞中表达的程度要低得多,青色和黄色模块出现在多个细胞群中,但分别在单核细胞群和中性粒细胞群中作用更强烈。为了评估这些细胞群的激活,我们分析了几组免疫反应和疾病相关基因特征在单个细胞中的激活分数。中性粒细胞、CD11b+巨噬细胞和单核细胞群具有较高的炎症模块和类固醇反应模块的评分;CD11b+巨噬细胞群和部分单核细胞、中性粒细胞和NK细胞群与哮喘模块有关;中性粒细胞群、CD11b-巨噬细胞群和大多数单核细胞群具有较高的重症哮喘模块评分。两个大型队列研究,SARP和U-BIOPRED,已经确定了 1 04个与严重哮喘的发病机制密切相关的基因。在这些基因中,Olfm4和Lcn2主要在中性粒细胞群中检测到,其表达具有类固醇抵抗性。在中性粒细胞、单核细胞、NK细胞和CD11b+巨噬细胞群中还鉴定了其他多个与严重哮喘相关的基因。这些数据表明,严重哮喘的发展受到多种免疫细胞的调控。6 嗜碱性粒细胞、ILC2和CD8+记忆T细胞差异表达IL-4和IL-13IL-4和IL-13是驱动2型免疫反应的关键细胞因子。地塞米松治疗不能抑制CD8-DCs和嗜碱性粒细胞表达IL-4,且促进Ly6C+和Ly6C-单核细胞、Tregs、CD103-DCs产生该细胞因子。IL-13在CD8+记忆T细胞、ILC2和嗜碱性粒细胞中表达有差异,其表达对糖皮质激素治疗不敏感,并且地塞米松治疗在一定程度上促进了 CD8+记忆T细胞IL-13的表达。7 嗜碱性粒细胞、ILC2和CD8+记忆T细胞的上游调节因子及通路分析为了了解哮喘恶化过程中嗜碱性粒细胞、ILC2和CD8+记忆T细胞的细胞内分子网络的激活情况,我们采用基因通路分析软件IPA(ingenuity pathway analysis)进行了基因富集分析。活化程度最高的经典通路的基因子集主要与“EIF2信号”有关,其次是“氧化磷酸化”和“Rho家族GTPase信号”。重要的是,这些通路的激活是糖皮质激素抵抗性的。上游调控因子分析预测了许多上游调控因子的高活化,包括STK11、NFE2L2、Hbb-b1、IFNy、CD38和IL-5,以应对HDM/LPS的刺激。除CD8+记忆T细胞中的TLR4、ILC2中的TLR3/IL-1β和嗜碱性粒细胞中的IL4/MYC外,大多数上游调控因子的激活具有类固醇抗性。结论LPS能够诱导HDM引起的哮喘加重,且是糖皮质激素抵抗性的。我们通过单细胞测序鉴定了 20个具有不同模式的主要免疫细胞亚群。对这些细胞的特征基因进行详细的检测后发现嗜碱性粒细胞、ILC2和CD8+记忆T细胞表达IL-4和IL-13在很大程度上是糖皮质激素抵抗的。这一前所未有的详细资料对于研究肺部先天性和适应性免疫细胞的特征以及为哮喘恶化患者制定有效的治疗策略至关重要。