白内障是发展中国家最主要的视力损害和致盲原因,随着白内障患者年轻化,白内障和近视的相关性逐渐引起了人们的重视。在众多危险因素中,已证实不同人种、不同地区情况下近视与核性白内障的发生发展有非常密切的关系。高度近视诱导的核性白内障,其特征不同与年龄相关性白内障:玻璃体液化、晶状体核硬度明显增加。目前在我国,近视患者的比例呈逐年上升的趋势,白内障手术年龄呈现年轻化的趋势,使我国现有的防盲任务更加艰巨。眼轴与玻璃体液化引起晶状体核硬化的机制已成为本领域研究的热点。目前高度近视并发核性白内障的研究主要基于流行病学调查和临床研究,尚无理想的动物模型用于发病机制的研究。近视并发核性白内障成因十分复杂,进一步探索并揭示高度近视核性白内障的发病机制是非常重要的。随着生物质谱技术和生物信息学迅猛发展,蛋白质组学研究成为生命科学的前沿。因此在蛋白质水平上发现关键靶蛋白,对我们揭示眼轴相关性核性白内障的形成机制以及潜在治疗靶点有重要意义,可为防盲工作提供更多依据。[目的]1通过超声弹性成像技术检测不同年龄、不同眼轴在体人晶状体核硬度,探讨其在眼轴相关性核性白内障研究方面的价值。2通过收集人白内障晶状体标本,利用定量蛋白质组学联合质谱技术,筛选和鉴定与眼轴及年龄相关的核性白内障晶状体核的相关蛋白质。3验证相关蛋白在临床病例中的表达,为探索与眼轴及年龄相关核性白内障发病机制,寻找能够作为治疗的新靶点提供重要理论依据。[方法]1年龄和眼轴相关性核性白内障晶状体核硬度的研究(1)超声弹性成像检测年龄相关性晶状体核硬度观察48例双眼晶状体透明或轻度混浊的临床受试者,根据年龄分为A,B,C组,每例任选一眼检测。A组16例16眼,女8眼,男8眼,均龄81±5.5岁。B组16例16眼,女6眼,男10眼,均龄44±3.2岁;C组16例16眼,女6眼,男10眼,均龄21±2.5岁。三组平均眼轴23.4±0.44(23~24mm),角膜地形图排除圆锥角膜对眼轴的影响,眼压:平均15.6±1.46 mm Hg(14mm Hg~19 mm Hg),排除全身疾病及眼部其他疾患,UCVA≥0.5,观察者知情同意。仪器采用Hitachi EUB 7500型彩色多普勒超声诊断仪(探头型号:EUP2L54M,7L,频率8~10MHz)。在超声弹性图中,绿色代表弹性成像感兴趣区(ROI)内组织的平均硬度,红色代表应变性较大,说明组织较软;蓝色表示应变性较小,组织硬度大。每例连续测量3次,取平均值。评价观察者晶状体弹性应变率与年龄变化的关系。(2)超声弹性成像检测屈光参差晶状体核硬度观察14例(28眼)单性高度近视性屈光参差、复性近视性屈光参差的临床病例,男5眼,女9眼,均龄62±3.3岁,平均眼压17.11±1.46 mm Hg(14mm Hg~20 mm Hg);角膜地形图排除圆锥角膜对眼轴的影响,排除全身疾病及眼部其他疾患;患者知情同意。每位患者长眼轴检测数据纳入A组(14眼),相对短眼轴检测数据纳入B组(14眼),超声弹性检测方法同上。观察长眼轴组与相对短眼轴组晶状体弹性应变率与眼轴的关系。2不同年龄、眼轴相关性核性白内障晶状体蛋白质组学研究(1)二维液相色谱联合i TRAQ标记法串联质谱鉴定、筛选不同年龄和眼轴晶状体核差异蛋白质通过白内障囊外摘除(ECCE)手术收集48例白内障患者的晶状体核,根据年龄和眼轴分为6组,每组8例:A组(平均眼轴28.7±1.5mm,平均年龄79.8±1.9岁),B组(平均眼轴28.7±1.4 mm,平均年龄58.0±4.0岁),C组(平均眼轴23.0±0.4 mm,平均年龄80.3±4.5岁),D组(平均眼轴23.0±0.3 mm,平均年龄56.9±4.2岁),E组(平均眼轴19.9±0.5 mm,平均年龄为75.1±2.5岁),F组(平均眼轴20.7±0.6 mm,平均年龄为57.6±5.3岁)。G组为透明晶状体对照组(平均眼轴23.5±0.6 mm,平均年龄为34.7±4.2岁),取自角膜移植供体的7枚透明晶状体核。每组提取晶状体水溶性,水不溶尿素溶性、水不溶尿素不溶性蛋白,每组蛋白质肽段混合,经过除盐、变性、还原、烷基化、酶解后分别进行稳定同位素114,115,116,117,118,119,121 i TRAQ标记、二维液相色谱分离,然后用串联质谱进行检测。所得质谱数据在IPIv3.45蛋白数据库进行检索鉴定,并进行差异蛋白质数据分析。实验技术重复两次,选择重复出现且表达趋势一致的蛋白质作为差异蛋白质进行分析。(2)Western blot法验证差异蛋白质收集新的白内障囊外摘除晶状体核组织20例,分4组,每组5例。A组(平均眼轴29.1±1.2mm,平均年龄59.0±3.0岁),B组(平均眼轴23.1±0.3mm,平均年龄55.8±3.5岁),C组(平均眼轴28.8±1.2mm,平均年龄78.4±1.9岁),D组(平均眼轴23.0±0.6 mm,平均年龄79.3±3.5岁)。提取晶状体水溶性,水不溶尿素溶性、水不溶尿素不溶性蛋白质组分(方法同前)。利用Western blot法对质谱检测中有意义的差异表达蛋白质进行验证。[结果]1晶状体超声弹性成像数据显示晶状体核硬度与年龄变化的关系在高龄组(A组),晶状体核区的应变率最小(0.02±0.08);在低龄组(C组),晶状体核区的应变率最大(1.95±0.87);中龄组(B组)晶状体核区的应变率为(0.69±0.12)。通过单因素方差分析显示:A组与B组,A组与C组,B组与C组比较均有统计学意义(P﹤0.005)。高龄组晶状体核应变率小,低龄组晶状体核应变率大。2晶状体超声弹性成像显示屈光参差患者晶状体核硬度与眼轴变化的关系长眼轴组晶状体核区的应变率为(0.16±0.08),相对短眼轴组晶状体核区的应变率为(0.54±0.16),独立样本t检验分析显示:两组间比较P﹤0.005,有统计学意义。长眼轴组晶状体核应变率小,相对短眼轴组晶状体核应变率大。3用i TRAQ技术筛选出了6个与眼轴相关的差异蛋白质,9个与年龄相关的差异蛋白质。第一次i TRAQ分析鉴定出148种蛋白质,第二次i TRAQ分析鉴定出103种蛋白质。选择两次结果的交集,共发现80种蛋白质。显著差异表达蛋白界值设定为:p值小于0.05,且差异倍数大于1.2倍或小于0.8倍的蛋白质。控制年龄因素后,80个蛋白质中分析得出6种蛋白质与轴性核性白内障密切相关。其中3种蛋白质在长眼轴组中上调,在短眼轴组中含量少,分别是γ-烯醇酶(Gamma-enolase),丙酮酸激酶同工酶M1/M2(Pyruvate kinase isozymes M1/M2)和山梨醇脱氢酶(Sorbitol dehydrogenase);另3种蛋白质在长眼轴组中表达下调,在短眼轴组中含量增高,分别是缝隙连接蛋白3(Gap junction alpha-3 protein),βB2-晶状体蛋白(Beta-crystallin B2),T-复合物多肽1(T-complex protein 1 subunit beta)。控制眼轴因素后,分析得出9种蛋白与年龄相关性核性白内障密切相关,其中2个蛋白质在高龄组中含量上调,在低龄组中含量少,分别是脂肪酸结合蛋白(Fatty acid-binding protein),蝶呤-4-α-甲醇胺脱水酶(Pterin-4-alpha-carbinolamine dehydratase);另7个蛋白质在高龄组中含量下调,在低龄组中含量增高,分别是αB-晶状体蛋白(Alpha-crystallin B chain),甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶(Betaine--homocysteine S-methyltransferase 1),血影蛋白β链(脑型1)(Spectrin beta chain-brain 1),晶状体蛋白(Phakinin),γC-晶状体蛋白(Gamma-crystallin C),磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate kinase 1),谷胱甘肽合成酶(glutathione synthetase)。4 Westen blot验证结果显示有2种与眼轴相关的蛋白质表达与质谱分析结果一致,分别为βB2-晶状体蛋白和山梨醇脱氢酶。验证了与年龄相关的2个蛋白质:αB-晶状体蛋白和谷胱甘肽合成酶,Western blot结果显示其表达均与质谱分析结果一致。[结论]1晶状体超声弹性成像可以成功获得在体晶状体弹性分布的定量信息。通过分析弹性应变率,可以了解在体晶状体的硬度情况,对晶状体核硬度的临床分级提供有效的补充。同时,可为白内障术中超声乳化能量的设置提供参考。2晶状体超声弹性成像显示:长眼轴晶状体核较短眼轴晶状体核硬。超声弹性成像对眼轴相关核性白内障的研究提供了核硬度定量的参考数据。3基于i TRAQ的比较蛋白质组学是一种有效的筛选眼轴相关核性白内障潜在差异蛋白质的研究手段。我们首次采用i TRAQ质谱技术鉴定出βB2-晶状体蛋白和山梨醇脱氢酶可能作为重要潜在的生物标志物,参与眼轴相关性核性白内障的发生发展。αB-晶状体蛋白和谷胱甘肽合成酶可能参与了年龄相关性核性白内障的形成。