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前言心肌持续性缺血可导致组织损伤和细胞死亡,尽管早期再灌注对组织非常重要,但再灌注后血液循环中白细胞附壁、聚积、渗出血管而浸润心肌,导致心肌细胞坏死,加之补体激活以及活性氧的产生,致使缺血性心肌损伤更为严重,即缺血/再灌注损伤（MI/RI）。心脏直视手术时冠状动脉血运被阻断,心肌处于缺血乏氧状态;当手术结束心肌恢复正常血运时又导致心肌新的损伤——再灌注损伤。如何最大限度地减轻心肌MI/RI一直是临床至关重要的课题。自1955年Melrose创用高钾停搏液以来,以高钾为主要成分的各种改良心肌保护液不断研制出来,明显改善了心肌保护的效果,提高了心脏手术的成功率。随着心脏外科技术的不断发展,先天性心脏病手术趋向幼龄化和复杂化。把适合于成熟心肌保护的停搏液直接应用于未成熟心肌保护是不合适的,缺乏理论和实验依据。近年来,未成熟心肌保护已成为心肌保护研究的热点之一。本研究中,由影像诊断和实验室基础研究两方面进行。首先应用高频超声检测幼兔的心功能的基本状态,以说明幼兔作为未成熟心肌的动物模型,其心肌的顺应性减低;然后采用幼兔离体缺血/再灌注心脏模型,测定其心肌的含水量以及心脏的冠脉储备功能;最后通过检测心肌细胞中TNF蛋白、TNF mRNA和Bcl-2蛋白表达的变化,以及心肌细胞凋亡情况,来探讨冷血浆停搏液对未成熟心肌的心脏功能的影响及其产生的机制,为冷血浆停搏液对未成熟心肌保护的临床研究提供实验依据和理论基础。方法论文一:选择14～26日龄日本大耳白兔,体重350～580g,20只,雌雄不拘（清洁级,中国医科大学第二临床学院动物实验室提供）。腹腔内注射10%水合氯醛3ml/kg全身麻醉幼兔后,幼兔胸部备皮,仰卧位固定,对幼兔进行超声检查。于胸骨旁左心室长轴二维图像,在腱索水平将M型取样线垂直于室间隔和左心室后壁获得M型超声心动图,根据ASE推荐法测定舒张末期及收缩末期左心室内径（EDD、ESD）及室间隔（IVS）和后壁厚度（LVPW）。应用Teichholtz公式法计算左心室射血分数（EF%）及左心室短轴缩短率（FS%）。于心尖四腔观,将取样容积置于二尖瓣瓣尖获得二尖瓣多普勒血流流速曲线（E,A）并计算E/A;用DTI-PW测定二尖瓣前后叶瓣环运动速度,获得二尖瓣瓣环舒张早期速度（Ea）和舒张晚期速度（Aa）并计算Ea/Aa。于心尖五腔心切面将取样容积放在二尖瓣与左室流出道之间描记多普勒频谱图,测量射血时间（ET）,二尖瓣口血流A峰终止处至下一心动周期二尖瓣口血流E峰开始处的时间间隔（a）,a-ET=等容收缩时间（ICT）+等容舒张时间（IRT）,利用公式Tei=（ICT+IRT）/ET=（a-ET）/ET计算出Tei指数。论文二:离体心脏制备与标本收集:腹腔注射10%水合氯醛3ml/kg,耳缘静脉注入肝素150U/kg抗凝,正中开胸摘取心脏,立即浸入4℃的盐水中,主动脉插管,连接Langendorff灌注装置,用37℃的K-H液灌注,灌注压为60cm H2O（5.88kPa）,灌注10分钟后收集10分钟的冠脉流出液。正常对照组立即终止灌注,取右室心肌作检测用。P组和B组降温同时开始分别灌注冷血浆停搏液或冷血停搏液（4℃）15ml/kg,灌注压为60cm H2O（5.88kPa）。低温（10℃）停搏30分钟后,开始复温并再灌注37℃K-H液,10分钟后收集冠脉流出液,实验结束时取右室心肌作检测用。测定灌注停搏液至心脏机械停搏时间、心脏停搏前、后工作心的复跳时间、心率、冠脉流量、心肌含水量。论文三:采用免疫组化、原位杂交、TUNEL法和RT-PCR方法检测心肌组织中TNF蛋白、TNF mRNA和Bcl-2蛋白表达及细胞凋亡发生情况。按照试剂盒说明书步骤操作。结果论文一1、M型超声检测的心功能指标:左心室射血分数正常值72.2±3.5%,短轴缩短率正常值37.5±3.0%。2、多普勒超声检测的心功能指标:二尖瓣血流频谱舒张早期峰值流速58.5±6.4cm/s,舒张晚期峰值流速72.6±5.7cm/s,二者之比0.81±0.07;二尖瓣环舒张早期速度6.8±1.5cm/s,舒张晚期速度8.5±2.3cm/s,二者之比0.84±0.24;Tei指数0.31±0.05。论文二1、灌注冷血浆停搏液和冷血停搏液至心脏机械停搏时间分别为40.5±2.2秒和80.0±2.0秒,差异显著（P＜0.01）。2、P组复跳时间、心率、冠脉流量和心肌含水量分别为46.4±8.7秒、142.4±22.7 bpm、12.3±2.4 ml/min和73%±5%,B组为88.6±10.2秒、122.8±14.7 bpm、6.4±2.2ml/min和82%±14%,差异显著（P＜0.05）:P组与B组复跳后心率恢复率及冠脉流量的恢复率比较,均具有显著差异（P＜0.05）。论文三1、在无缺血/再灌注的未成熟心肌组织中没有TNF蛋白和TNF mRNA表达,染色呈阴性;但是,在经历缺血/再灌注的实验组,心肌组织中TNF蛋白和TNFmRNA表达明显,P组染色呈弱阳性或阳性,而B组呈强阳性或阳性。2、在无缺血/再灌注的对照组心肌组织中没有看到凋亡细胞;在经历缺血/再灌注的实验组,出现少量心肌细胞凋亡。3、缺血/再灌注损伤可以使心肌组织中Bcl-2 mRNA表达减弱;对照组心肌组织中Bcl-2蛋白相对含量为0.921±0.015,P组为0.712±0.021,B组为0.504±0.028,差异显著（P＜0.01或P＜0.05）。结论1、幼兔的心功能示心肌顺应性低,舒张功能减低,收缩功能正常。2、冷血浆停搏液具有可使幼兔心脏快速停搏于舒张期的作用。3、与冷血停搏液相比,冷血浆停搏液可明显提高幼兔心率及冠脉流量的恢复率,减轻心肌水肿。4、在缺血/再灌注过程中,冷血浆停搏液能抑制TNF蛋白和TNF mRNA在心肌内的表达,上调Bcl-2蛋白在心肌内的表达,从而抑制或延缓未成熟心肌细胞凋亡的发生。