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尿素(H2N-CO-NH2)是最简单的含氮有机化合物之一。可广泛应用于除冰剂、发泡剂、除草农药及农业肥料的生产和汽车尾气处理等领域。农业氮肥浸出、以尿素为原料的工业生产和人类生活均产生大量含尿素废水。另外,含尿素废水往往伴随着高盐(Na Cl>10 g/L)的问题。含尿素的偶氮二甲酰胺发泡剂工业污水(Na Cl=56 g/L)、沿海城市冲厕污水(Na Cl=10-17 g/L)和船舶生活污水(Na Cl=10-20 g/L)均有高含盐量。由此产生的高盐含尿素废水,会对人类健康、水生生物生存和生态环境安全构成威胁。因此,亟需对高盐含尿素废水进行有效处理。本文筛选鉴定出一株可水解尿素并具有同步异养硝化—好氧反硝化(SND)脱氮功能的菌株Halomonas sp.H36,优化该菌株尿素酶的产酶条件,探究该菌株尿素酶的酶学性质,考察高盐下该菌株以尿素为底物的脱氮进程,最后利用该菌株处理模拟海洋船舶生活污水。(1)利用尿素为唯一氮源对实验室保藏的13株耐盐生长菌株进行生长培养,并测定其生长量和尿素酶活性。然后转移至脱氮基质,测定其同步异养硝化—好氧反硝化(SND)脱氮率。筛选出一株同步尿素水解—SND脱氮的耐盐生长菌株H36。经鉴定,菌株H36为革兰氏阴性菌,与Halomonas taeanensis NY-3的16S r DNA序列相似性为99.4%。本文将菌株H36命名为Halomonas sp.H36。考察Halomonas sp.H36在不同Na Cl浓度下生长及产尿素酶。当培养基中Na Cl=60 g/L时,该菌株的生长量和尿素酶活性达到最高,分别为10.26 g/L,75.28 U。Halomonas sp.H36合成的四氢嘧啶(Ectoine)总浓度不受培养基中Na Cl浓度的影响,该菌株Ectoine总浓度平均值为1303.02 mg/L。Halomonas sp.H36为Ectoine分泌型菌株。当培养基中Na Cl=30 g/L时,该菌株的Ectoine分泌率为78.28%,达到最高值。(2)应用响应面法,优化Halomonas sp.H36尿素酶的产酶条件。优化后该菌株产尿素酶培养基(g/L):葡萄糖40.26,谷氨酸单钠20,硫酸铵15.06,Na Cl 34.90,尿素5,Mn SO4·H2O 0.01,KH2PO43,Mg SO4·7H2O 0.4,K2HPO4·3H2O 9,酵母粉1,混合微量元素2 m L。优化后Halomonas sp.H36尿素酶活性提高了47.72%。(3)从酶的诱导性、酶反应条件和米氏方程三个方面,考察Halomonas sp.H36尿素酶的酶学性质。该菌株尿素酶具有诱导性。该菌株尿素酶反应条件的优化结果为p H=8、T=50℃、Na Cl浓度为0 g/L,尿素浓度为50 g/L。该菌株尿素酶与底物(尿素)的关系符合Michaelis-Menten。Km=16.70 m M,Vmax=140.85 m M/(mg·min)。(4)从分子生物学和酶学水平,进行Halomonas sp.H36以尿素为底物的脱氮研究。成功扩增出Halomonas sp.H36脱氮相关酶基因(或片段)(ure A、amo A、nir S、nar H)。酶反应体系中不同浓度的Na Cl会对Halomonas sp.H36脱氮相关酶(尿素酶,Urease;氨单加氧酶,AMO;硝酸盐还原酶,NAR;亚硝酸盐还原酶,NIR)活性产生影响。Na Cl=0 g/L,该菌株脱氮相关酶活性最大。随着Na Cl浓度的升高,该菌株脱氮相关酶活性有不同程度的降低。Na Cl=120 g/L,该菌株尿素酶、氨单加氧酶、亚硝酸盐还原酶、硝酸盐还原酶活性仍分别保留了74.25%、22.26%、32.01%、26.82%。Halomonas sp.H36在高盐下以尿素为底物的脱氮进程中,CO(NH2)2-N去除率为74.77%,总氮(TN)去除率为57.67%。Halomonas sp.H36具有以尿素为初始底物,同步尿素水解-硝化-反硝化的功能,可同时去除高盐含尿素废水中的CO(NH2)2-N和无机氮(NH4+-N、NO2--N、NO3--N)。(5)应用Halomonas sp.H36处理模拟海洋船舶生活污水。192 h后,CO(NH2)2-N去除率为88.07%,氨氮(NH4+-N)去除率为91.42%,TN去除率为90.33%,亚硝酸态氮(NO2--N)和硝酸态氮(NO3--N)没有积累。Halomonas sp.H36有降解总糖和蛋白质的能力。在模拟海洋船舶生活污水中,该菌株总糖降解率89.73%,蛋白质降解率为97.68%。本文从盐单胞菌中同时成功扩增出脱氮相关酶基因(或片段)(ure A、amo A、nir S、nar H)。证明了盐单胞菌具有以尿素为初始底物,同步尿素水解-硝化-反硝化的功能,可同时去除高盐含尿素废水中的CO(NH2)2-N和无机氮(NH4+-N、NO2--N、NO3--N)。