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背景心室重构心肌细胞肥大是心脏在受到损伤或超负荷状态下,出现复杂的分子信号的改变和胚胎基因及蛋白的再表达,从而造成心肌细胞适应不良性肥大,在临床上表现为心室肌肥厚,心室容量的增加和心室结构的改变。进一步发展可导致心衰、猝死,是远期发生心源性死亡的最重要的危险因素之一。心肌细胞肥大是心室重构重要表现。凝集素样氧化性低密度脂蛋白受体(Lectin-like oxidized LDL receptor, LOX-1)属于C型血凝素家族,是一种II型膜蛋白,能被多种病理刺激所诱导。研究证实LOX-1可能是多种因素导致心肌肥大的重要途径。我们的前期研究已证实中药开心胶囊具有抗心梗后心室重构的作用。本项目将采用心脏超声、HE染色、RNA干扰、慢病毒、Western-Blot及RT-PCR等技术探索开心胶囊对LOX-1通路的影响进行研究,发掘心梗后心室重构的治疗靶点及有效药物,丰富中药治疗的疗效机理,为心梗后心室重构的防治探索一条新的思路和途径。方法1开心胶囊对心梗后心肌细胞肥大及LOX-1表达的影响选用SPF级雄性Wistar大鼠,结扎左冠状动脉主干造成心肌梗塞模型。将符合重构标准条件的大鼠随机分成5组：模型组、开心胶囊高、中、低剂量组、卡托普利组；加上假手术组,共6组,每组12只,共72只。12周后处死大鼠,采用心脏超声观察大鼠心脏结构,HE染色检测心肌细胞横截面面积,Westrenbolt法检测大鼠心肌LOX-1的表达水平。2靶向LOX-1RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定利用pLL3.7慢病毒系统构建靶向LOX-1RNA干扰慢病毒载体。3过表达LOX-1慢病毒载体的构建及鉴定利用pHIV-H2BmRFP慢病毒系统构建过表达LOX-1慢病毒载体。4不同浓度开心胶囊对H9C2心肌细胞活力的影响传代细胞培养24h后,用含1%胎牛血清的DMEM培养基配制药物,将细胞随机分为6组：对照组(Control),开心胶囊2.5mg/ml组,开心胶囊5mg/ml组,开心胶囊10mg/ml组,开心胶囊20mg/ml组,开心胶囊40mg/ml组,开心胶囊80mg/ml组,每孔6孔。继续培养24小时后,MTT法检测细胞活性。5开心胶囊及抑制LOX-1对AngⅡ诱导心肌细胞肥大及LOX-1表达的影响将侵染对照病毒LV.NC的心肌细胞(H9C2Nc细胞)传代细胞培养24h后,用含1%胎牛血清的DMEM培养基配制药物,将细胞随机分为6组：Control组,AngⅡ组：AngⅡ10-7M, KXJN低剂量组(KXJN2.5mg/ml):Ang Ⅱ10-7M+KXJN2.5mg/ml; KXJN中剂量组(KXJN5mg/ml):Ang Ⅱ10-7M+KXJN5mg/ml;开心胶囊高剂量组(KXJN10mg/ml):Ang Ⅱ10-7M+KXJN10mg/ml,抑制LOX-1组(LOX-1RNAi) H9C2LOX-1-RNAi细胞+Ang Ⅱ10-7M。继续培养24小时后,免疫荧光染色检测细胞面积,BCA法检测细胞蛋白含量,Westren bolt法检测大鼠心肌LOX-1的表达水平。6过表达LOX-1对心肌细胞肥大及LOX-1表达的影响及开心胶囊的调控H9C2Nc及H9C2LOX-1+细胞传代细胞培养24h后,用含1%胎牛血清的DMEM培养基配制药物,将细胞随机分为5组：Control组：H9C2NC细胞,过表达LOX-1组(LOX-1+):H9C2LOX-1+细胞,开心胶囊低剂量组(KXJN2.5mg/ml):H9C2LOX-1+细胞+KXJN2.5mg/ml,开心胶囊中剂量组(KXJN5mg/ml):H9C2LOX-1+细胞+KXJN5mg/ml),开心胶囊高剂量组(KXJN10mg/ml):H9C2LOX-1+细胞+KXJN10mg/ml)。继续培养24小时后,免疫荧光染色检测细胞面积,BCA法检测细胞蛋白含量,Westren bolt法检测大鼠心肌LOX-1的表达水平。结果1开心胶囊对心梗后心室重构大鼠心肌细胞肥大的影响至实验观察终点,共存活大鼠64只,其中假手术组12只,模型组9只,开心胶囊低、中剂量组各10只,开心胶囊高剂量组及卡托普利治疗组各11只。大鼠死因考虑为严重心律失常、心力衰竭及术后感染。给药12周后不同分组的心脏质量指数差异有显著性(F=57.709,P=0.000),模型组的心脏质量指数上升,与对照组比较有统计学差异(P=0.000),不同剂量在开心胶囊组及卡托普利组的心肌细胞面积低于模型组,与模型组比较差异有统计学意义(P=0.000),不同剂量开心胶囊组、卡托普利组间的心肌细胞面积差异无统计学意义(P>0.05)。不同分组LVDd差异有显著性(F=63.810,P=0.000),模型组的LVDd上升,与对照组比较有统计学差异(P=0.000),不同剂量开心胶囊组及卡托普利组的LVDd小于模型组,与模型组比较差异有统计学意义(P=0.000)。开心胶囊中剂量组和高剂量组的LVDd氐于低剂量组,与低剂量组比较有统计学差异(P=0.001,P=0.000),开心胶囊高剂量组的LVDd有低于中剂量组的趋势,但与中剂量组比较差异无统计学意义(P=0.561)。开心胶囊低剂量组与卡托普利组差异有统计学意义(P=0.000),开心胶囊中、高剂量组与卡托普利组比较无统计学意义(开心胶囊中剂量组：P=0.109；开心胶囊高剂量组：P=0.322)。不同分组LVDs差异有显著性(F=447.947,P=0.000),模型组的LVDs上升,与对照组比较有统计学差异(P=0.000),不同剂量开心胶囊组及卡托普利组的LVDs小于模型组,与模型组比较差异有统计学意义(P=0.000)。开心胶囊中剂量组和高剂量组的LVDs低于低剂量组,与低剂量组比较有统计学差异(P=0.000),开心胶囊高剂量组的LVDs有低于中剂量组的趋势,但与中剂量组比较差异无统计学意义(P=0.285)。开心胶囊低剂量组与卡托普利组差异有统计学意义(P=0.000),开心胶囊中、高剂量组与卡托普利组比较无统计学意义(开心胶囊中剂量组：P=0.095；开心胶囊高剂量组：P=0.529)。不同分组LVEF差异有显著性(F=227.891,P=0.000),模型组的LVEF下降,与对照组比较有统计学差异(P=0.000),开心胶囊组及卡托普利组的LVEF高于模型组,与模型组比较差异有统计学意义(P=0.000)。开心胶囊中剂量组和高剂量组的LVEF高于低剂量组,与低剂量组比较有统计学差异(P=0.000)。开心胶囊高剂量组的LVEF高于中剂量组,与中剂量组比较差异有统计学意义(P=0.041)。开心胶囊低剂量组与卡托普利组差异有统计学意义(P=0.000),开心胶囊中、高剂量组与卡托普利组比较无统计学意义(开心胶囊中剂量组：P=0.349；开心胶囊高剂量组：P=0.245)。不同分组LVFS差异有显著性(F=302.783,P=0.000),模型组的LVFS下降,与对照组比较有统计学差异(P=0.000),开心胶囊组及卡托普利组的LVDs小于模型组,与模型组比较差异有统计学意义(P=0.000)。开心胶囊中剂量组和高剂量组的LVFS高于低剂量组,与低剂量组比较有统计学差异(开心胶囊中剂量组：P=0.002；开心胶囊高剂量组：P=0.000)。开心胶囊高剂量组的LVFS高于中剂量组,与中剂量组比较差异有统计学意义(P=0.05)。开心胶囊低剂量组与卡托普利组差异有统计学意义(P=0.000),开心胶囊中、高剂量组与卡托普利组比较无统计学意义(开心胶囊中剂量组：P=0.095；开心胶囊高剂量组：P=0.529)。不同分组心肌细胞横切面面积差异有显著性(F=24.244,P=0.000),模型组的心肌细胞横切面面积上升,与对照组比较有统计学差异(P=0.000),不同剂量开心胶囊组及卡托普利组的心肌细胞横切面面积低于模型组,与模型组比较差异有统计学意义(P=0.000)。开心胶囊中剂量组、高剂量组的心肌细胞横切面面积高于低剂量组,与低剂量组比较有统计学差异(开心胶囊中剂量组：P=0.042；开心胶囊高剂量组：P=0.000)。开心胶囊高剂量组的LVFS高于中剂量组,与中剂量组比较差异有统计学意义(P=0.048)。开心胶囊低、中剂量组与卡托普利组差异有统计学意义(开心胶囊低剂量组：P=0.000；开心胶囊中剂量组：P=0.021),开心胶囊高剂量组与卡托普利组比较无统计学意义(P=0.707)。2开心胶囊对心梗后心肌LOX-1表达的影响不同分组心肌LOX-1表达水平差异有显著性(F=44.281,P=0.000),模型组的LOX-1表达水平上升,与对照组比较有统计学差异(P=0.000),不同剂量组开心胶囊组LOX-1表达水平低于模型组,与模型组比较差异有统计学意义(开心胶囊低剂量组：P=0.007；其他组：P=0.000),开心胶囊中剂量组、高剂量组的LOX-1表达水平低于低剂量组,与低剂量组比较有统计学差异(开心胶囊中剂量组：P=0.001；开心胶囊高剂量组：P=0.000)。开心胶囊高剂量组的LOX-1表达水平低于中剂量组,与中剂量组比较差异有统计学意义(P=0.000)。开心胶囊低剂量组LOX-1表达高于卡托普利组,与卡托普利组差异有统计学意义(P=0.000),开心胶囊中剂量组LOX-1表达高于卡托普利组,但与卡托普利组比较无统计学意义(P=0.399)。开心胶囊高剂量组LOX-1表达低于卡托普利组,与卡托普利组比较差异有统计学意义(P=0.043)。3靶向LOX-1RNA干扰慢病毒载体的构建慢病毒侵染72h后观察侵染效率约为95%。不同靶点慢病毒侵染H9C2细胞72h后,LV.LOX1-562组及LV.LOX1-628组的LOX-1mRNA水平较LV.NC组下降,差异有统计学意义(P=0.000); LV.LOX1-601组LOX-1mRNA水平较LV.NC有下降的趋势,但差异无统计学意义(P=0.142)。4过表达LOX-1慢病毒载体的构建Lv.LOX-1+侵染72h后观察侵染效率约为95%。侵染H9C2细胞72h后LOX-1mRNA水平较阴性慢病毒感染组显著升高(t=-18.68,P=0.000)5不同浓度开心胶囊对H9C2心肌细胞活力的影响不同浓度的开心胶囊水提物对心肌细胞的作用效应不同(F=535.588,P=0.000),低剂量的药物浓度(5-20mg/ml)细胞活性与Control组比较,没有统计学差异(P=0.842,P=0.062,P=212)。40mg/ml作用24小时后细胞活力下降了约30%,与Control组比较有统计学差异(P=0.000)。60mg/ml作用24小时后细胞活力下降了60%,与Control组比较有统计学差异(P=0.000)80mg/ml作用24小时后细胞活力下降了80%,,与Control组比较有统计学差异(P=0.000)。因此本实验所用的开心胶囊水提物浓度为2.5、5、10mg/ml,以排除药物自身对细胞的毒性作用。6开心胶囊及抑制LOX-1对AngⅡ诱导心肌细胞肥大的影响不同分组心肌细胞面积差异有显著性(F=126.041, P=0.000), AngⅡ组的心肌细胞面积上升,与Control组比较有统计学差异(P=0.000)。不同剂量开心胶囊组及LOX-1RNAi组的心肌细胞面积低于Ang Ⅱ组,与Ang Ⅱ组比较差异有统计学意义(P=0.000)。开心胶囊中剂量组和高剂量组的心肌细胞面积小于低剂量组,与低剂量组比较有统计学差异(开心胶囊中剂量组：P=0.010；开心胶囊高剂量组：P=0.000),开心胶囊高剂量组细胞面积小于中剂量组,中剂量组比较差异有统计学意义(P=0.000)。开心胶囊低、中剂量组心肌细胞面积大于LOX-1RNAi组,与LOX-1RNAi组比较有统计学意义(P=0.000),开心胶囊高剂量组心肌细胞面积有高于LOX-1RNAi组的趋势,但与LOX-1RNAi组比较无统计学差异(P=0.271)不同分组心肌细胞蛋白含量差异有显著性(F=36.121,P=0.000),Ang II组的心肌细胞蛋白含量上升,与Control组比较有统计学差异(P=0.000)。不同剂量开心胶囊组及LOX-1RNAi组的心肌蛋白含量低于Ang Ⅱ组,与Ang II组比较差异有统计学意义(开心胶囊低剂量组：P=0.004；其他组：P=0.000)。开心胶囊中、高剂量组的心肌蛋白含量低于低剂量组,与低剂量组比较有统计学差异(开心胶囊中剂量组：P=0.009；开心胶囊高剂量组：P=0.000)。开心胶囊高剂量组蛋白含量低于中剂量组,与中剂量组比较差异有统计学意义(P=0.014)。开心胶囊中、低剂量组心肌蛋白含量高于LOX-1RNAi组,与AngⅡ组比较有统计学意义(开心胶囊低剂量组：P=0.000；开心胶囊中剂量组：P=0.001)。开心胶囊高剂量组心肌细胞面积有高于LOX-1RNAi组的趋势,但与LOX-1RNAi组比较差异无统计学意义(P=0.313)。7开心胶囊及抑制LOX-1对Ang II诱导心肌细胞LOX-1表达的影响不同分组心肌细胞LOX-1表达差异有显著性(F=83.259,P=0.000), AngⅡ组的心肌细胞LOX-1表达上升,与Control组比较有统计学差异(P=0.000)。不同剂量开心胶囊组及LOX-1RNAi组的心肌LOX-1表达低于Ang II组,与Ang II组比较差异有统计学意义(P=0.000)。开心胶囊中剂量组和高剂量组的心肌LOX-1表达低于低剂量组,与低剂量组比较有统计学差异(开心胶囊中剂量组：P=0.004；开心胶囊高剂量组P=0.000)。开心胶囊高剂量组LOX-1表达低于中剂量组,与中剂量组比较差异有统计学意义(P=0.000)。开心胶囊低、中、高剂量组心肌LOX-1表达低于LOX-1RNAi组,与LOX-1RNAi组比较有统计学意义(开心胶囊低、中剂量组：P=-0.000；开心胶囊高剂量组：P=0.006)。8过表达LOX-1对心肌细胞肥大的影响及开心胶囊的调控不同分组心肌细胞面积差异有显著性(F=343.583,P=0.000),LOX-1+组的心肌细胞面积上升,与Control组比较有统计学差异(P=0.000)。不同剂量开心胶囊组心肌细胞面积低于LOX-1+组,与LOX-1+组比较差异有统计学意义(P=0.000)。开心胶囊中剂量组和高剂量组的心肌细胞面积小于低剂量组,与低剂量组比较有统计学差异(P=0.000),开心胶囊高剂量组细胞面积小于中剂量组,中剂量组比较差异有统计学意义(P=0.000)。不同分组心肌蛋白含量差异有显著性(F=209.101,P=0.000),LOX-1+组的心肌蛋白含量上升,与Control组比较有统计学差异(P=0.000)。不同剂量开心胶囊组心肌蛋白含量低于LOX-I+组,与LOX+组比较差异有统计学意义(P=0.000)。开心胶囊中剂量组和高剂量组的心肌蛋白含量小于低剂量组,与低剂量组比较有统计学差异(P=0.000),开心胶囊高剂量组蛋白含量小于中剂量组,与中剂量组比较差异有统计学意义(P=0.000)。9开心胶囊对H9C2LOX-1+心肌细胞LOX-1表达的影响不同分组心肌细胞LOX-1表达差异有显著性(F=308.125,P=0.000), LOX-1+组的心肌细胞LOX-1表达上升,与Control组比较有统计学差异(P=0.000)。不同剂量开心胶囊组的心肌LOX-1表达低于LOX-1+组,与LOX-1+组比较差异有统计学意义(P=0.000)。开心胶囊中剂量组和高剂量组的心肌LOX-1表达低于低剂量组,与低剂量组比较有统计学差异(P=0.000)。开心胶囊高剂量组LOX-1表达低于中剂量组,与中剂量组比较差异有统计学意义(P=0.000)。开心胶囊高剂量组心肌细胞LOX-1表达低于Control组,与Control组比较差异有统计学意义(P=0.000)。结论1开心胶囊是治疗心室重构的有效药物2开心胶囊具有抑制心肌细胞肥大的作用,其机制可能与抑制LOX-1有关3LOX-1可能在心肌细胞肥大中发挥关键作用4LOX-1基因的562片段是进行RNA干扰的理想位点