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解旋酶作为生物中心法则中重要的参与者,在体内基因解链、修复、重组等方面发挥着重要作用。RecD作为SF1B解旋酶家族中的重要一员,广泛存在于原核与真核生物中。其分为两类,一类需要其他亚基协助发挥功能的亚基形式,如典型的Re BCD蛋白复合体;另一类为独立发挥功能与其基因序列同源的被称为RecD2。耐辐射球菌能够在极端条件下存活,如电离辐射、紫外线照射、双氧水处理等,能够大量修复损伤的双链DNA,在生理属性、酶途径等方面受到广泛研究。目前,在酶动力学方面,RecD2解旋酶主要停留在与双链DNA的研究上,其他方面还未广泛深入探索,与特殊DNA之间的相互作用尚不清楚,尤其是G4DNA。G4结构以四螺旋存在于生物体内,主要涉及生物体衰老、死亡、癌变等现象。本研究经合作实验室提供已鉴定正确的p ET22b-RecD2质粒,通过原核表达纯化得到RecD2解旋酶。利用荧光各项异性值法、荧光快速停留检测技术对RecD2解旋酶与DNA的结合活性与解旋活性进行分析,特别是G4DNA。为进一步研究RecD2解旋酶的生理功能以及解旋酶家族成员间在结构、功能等方面的共性与区别提供参考依据。主要获得了以下结果:1.将质粒p ET22b-RecD2转化入E.coli BL21表达菌株中,3L LB、37℃、1mM IPTG诱导培养3h。结合AKTA蛋白纯化系统,先后经镍亲和层析(5m L His Trap Ni)与阴离子层析(5m L His Trap Q)纯化,得到共3mg纯度大于95%的RecD2解旋酶,理论分子量为76.38KD。2.采用荧光各项异性值法,在20mM Tris-HCl pH7.5、4mM Mg Cl2、1mM DTT条件下,检测RecD2与16nt ss DNA结合时发现,盐浓度明显影响其结合能力。50mM NaCl时,Km为11.29n M,RecD2与DNA亲和力最强。3.在上述同样条件下,检测RecD2与不同DNA结合活性时发现,RecD2解旋酶能够结合带有5’尾链的G4 DNA,Km为13.96±0.034n M,且优于16bp ds DNA,与16nt ss DNA相差无几。4.在25mM Tris-HCl pH7.5、50 mM NaCl、2 mM Mg Cl2、2 mM DTT,25℃孵育2min条件下,检测RecD2与不同G4 DNA结合能力强弱时发现,RecD2解旋酶与G4DNA结合存在底物方向偏向性,当与带有同等长度的尾链G4DNA作用时,偏向于5’-3’。5.采用荧光共振能量转移原理检测RecD2与5’14nt20bp DNA、fork12nt20bp DNA解旋反应发现,RecD2均能高效解旋,且与盐浓度呈反相关,盐浓度越高,解旋活性越弱。6.利用荧光快速停留技术检测发现,RecD2解旋酶能够解旋G4 DNA。通过单一变量法,探讨pH、NaCl浓度、Mg Cl2浓度对其解旋G4的影响发现,不同pH、温度作用较为明显。当pH大于7.0时,解旋速率明显提高;孵育温度为37℃时,解旋迅速加快。同时,其解旋基本适宜条件为:25mM Tris-HCl pH7.5、50mM NaCl、2mM Mg Cl2、2mM DTT,37℃。在该条件下,解旋速率达到5.268±0.38 s-1。7.在25mM Tris-HCl pH7.5、100 mM NaCl/KCl、10 mM Mg Cl2、1mM DTT,30℃,孵育5min条件下,发现RecD2解旋酶与26nt17bp的解旋速率比26nt G417bp的解旋速率低了0.308s-1,但在解旋幅度上却高了很多。表明G4 DNA可能不是RecD2的天然底物,G4结构对RecD2蛋白解旋双链存在一定的阻滞作用。本研究纯化了RecD2解旋酶,发现其能够结合并且解旋G4DNA,且G4结构对RecD2解旋双链存在阻挡作用,这为深入研究解旋酶家族在功能与性质上的共性与区别提供了基础。