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目的:构建含多聚磷酸盐激酶(PPK)基因的重组质粒PAX01-PPK,转化到枯草芽孢杆菌WB800N中,研究其蛋白的表达及酶活性,为慢性肾功能衰竭高磷血症的治疗提供了一种新的思路。方法:1.根据GenBank数据库中大肠杆菌K-12中多聚磷酸盐激酶的基因序列,经生物合成后,得到基因片段PPK。2.根据目的基因序列设计引物,经PCR扩增后,回收及纯化。将PPK及质粒PAX01分别经双酶切后连接,构建成重组质粒PAX01-PPK,转化至大肠杆菌DH5a,筛选并测序鉴定。3.提取已成功转化至大肠杆菌DH5a的重组质粒PAX01-PPK,通过电转化的方式将其转至枯草芽孢杆菌WB800N,筛选及鉴定。4.在重组菌PAX01-PPK/WB800N中加入木糖,诱导目的基因表达,同时设定未诱导组进行对照,并对表达产物行SDS-PAGE及Western Blot的分析及鉴定。5.配制磷的标准溶液,测定OD值,并绘制磷的标准曲线。将能表达目的蛋白的工程菌PAX01-PPK/WB800N接种于一定磷浓度的诱导培养基中培养24小时,并设定对照组,取培养液,测定OD值,鉴定其酶活性。结果:1.将含重组质粒PAX01-PPK的大肠杆菌DH5a,经菌液PCR、重组质粒双酶切及测序鉴定,结果与目的片段大小相符合。2.应用电转化的方法成功将重组质粒PAX01-PPK转至枯草芽孢杆菌WB800N,经菌液PCR鉴定,得到一为大小约2.085Kb的片段,符合目的基因大小。3.SDS-PAGE分析结果显示:重组枯草芽孢杆菌PAX01-PPK/WB800N经诱导后成功表达出一分子量为81KD的蛋白,与目的蛋白预期值相同。Western Blot鉴定结果表明:在81KD处可见一特异性条带,符合理论值大小。4.酶活性检测结果:绘制出了磷标准曲线;24小时后,接种了重组菌PAX01-PPK/WB800N的含磷的诱导培养中的磷浓度均较前降,而对照组无明显变化,提示经诱导表达的多聚磷酸盐激酶具有酶活性。结论:成功构建重组枯草芽孢杆菌PAX01-PPK/WB800N,能诱导多聚磷酸盐激酶表达,且具有酶活性。