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背景弥漫性肺泡上皮损伤是急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)的基本病理改变,有效修复损伤肺泡上皮对治疗ARDS具有关键作用。前期实验已证实经典Wnt通路能促进外源性间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)在ARDS小鼠肺内分化为肺上皮细胞,其具体机制不清。细胞周期在MSC分化中发挥关键作用,p130/E2F4是调控细胞周期的重要途径,而经典Wnt通路能调节p130/E2F4。推测经典Wnt通路通过调节p130/E2F4影响MSC的细胞周期进而调控其向肺泡上皮细胞定向分化。本研究旨在探讨Wnt/β-Catenin-p130/E2F4调控细胞周期影响MSC向II型肺泡上皮细胞分化的机制及高表达p130或E2F4的MSC对ARDS小鼠肺损伤修复的意义。第一部分高表达p130/E2F4调控MSC细胞周期对其多向分化潜能影响的研究目的评价高表达p130/E2F4对小鼠骨髓来源间充质干细胞(mouse bone marrow derived mesenchymal stem cells,mMSCs)多项潜能的影响及相关机制探讨。方法(1)通过慢病毒方法构建高表达p130或E2F4的质粒,设立只表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的空白对照质粒,然后分别通过Lipofectamine2000与包装质粒共同转染293T细胞,之后转染mMSCs;高表达细胞株用Blasticidin进行药物筛选,挑取克隆纯化传代培养20代后,荧光显微镜下观察报告基因GFP阳性细胞,并通过流式细胞仪分析GFP阳性细胞比率,qRT-PCR和Western blot检测mMSCs的p130或E2F4基因和蛋白表达水平评估转染效率。(2)通过碘化丙锭染色及流式细胞法检测慢病毒转染后及诱导分化后mMSCs细胞周期变化。(3)体外诱导转染后细胞株成骨、成脂及成软骨分化,并通过qRT-PCR测定成骨基因OSX及Runx2、成脂基因PPAR-γ及C/EBPα、成软骨基因Sox9及Co12α1 mRNA表达水平,同时Western bolt检测相应蛋白表达,评估基因转染对mMSCs成骨、成脂及成软骨分化的作用。(4)CCK-8法评估基因转染对mMSCs增殖的作用。(5)划痕实验及Transwell小室迁移实验评估基因转染对mMSCs的迁移能力的作用。结果(1)慢病毒介导的高表达p130或E2F4基因转染mMSCs,传代培养20代后,转染效率仍高达80.3～84.4%;与正常对照组(MSC-NC组)细胞相比,高表达p130的mMSCs(MSC-p130组)或高表达E2F4的mMSCs(MSC-E2F4组)p130或E2F4mRNA和蛋白水平均显著增加(P<0.0001)。(2)诱导分化前,MSC组、MSC-NC组、MSC-p130组和MSC-E2F4组细胞周期无明显差异(P>0.05);成骨及成脂诱导分化后,MSC-p130组及MSC-E2F4组细胞G1期较MSC-NC组细胞明显延长(P<0.05),但成软骨诱导分化后,MSC-p130及MSC-E2F4组细胞G1期较MSC-NC组细胞明显缩短(P<0.05)。(3)与MSC-NC组相比,MSC-p130组及MSC-E2F4组成骨分化明显增加,而成脂分化及成软骨分化明显受到抑制。(4)通过比较各组细胞的增殖曲线发现,第1d至第7d,与MSC-NC组相比,MSC-p130组及MSC-E2F4组细胞的增殖能力无明显变化(P>0.05)。(5)划痕后12h,MSC-p130组和MSC-EF24组划痕宽度较MSC-NC组明显缩小(P<0.05),而Transwell迁移实验也观察到,与MSC-NC组相比,MSC-p130和MSC-E2F4组细胞迁移明显增多(P<0.05)。结论慢病毒载体介导的p130或E2F4基因高表达转染mMSCs长期、稳定且高效,并可进一步增加mMSCs在体外成骨分化,抑制成脂、成软骨分化。这种高表达p130或E2F4对mMSCs多项潜能的影响与调控细胞周期G1期相关。第二部分Wnt/β-Catenin-p130/E2F4调控MSC体外分化为II型肺泡上皮细胞的机制研究目的明确Wnt/β-Catenin-p130/E2F4对mMSCs向II型肺泡上皮细胞(type Ⅱalveolar epithelial cells,AT Ⅱ)分化的作用及其相关机制。方法(1)在小鼠肺上皮细胞系-12(murinelungepithelial-12,MLE-12)共培养结合小气道上皮培养基体外诱导高表达p130或E2F4的mMSCs分化为AT Ⅱ后7d、14d,免疫荧光检测AT Ⅱ特异性标志物肺表面活性蛋白C(surfactant protein C,SP-C)蛋白表达情况以及透射电镜下观察AT Ⅱ细胞特征性细胞器板层小体形成情况;并提取mMSCs蛋白,Westemblot法检测SP-C蛋白表达;(2)在MLE-12细胞共培养结合SAGM体外诱导mMSCs分化为AT Ⅱ的基础上,分别加入经典Wnt信号通路激活剂氯化锂(LiCl)或抑制剂Dickkopf相关蛋白1(Dickkopf-related protein 1,DKK-1)调节mMSCs的经典Wnt信号,诱导分化后提取mMSCs的蛋白,Westernblot法检测SP-C、p130及E2F4蛋白表达;(3)在MLE-12细胞共培养结合SAGM体外诱导高表达p130或E2F4的mMSCs分化为AT II的基础上,加入DKK-1抑制经典Wnt信号通路,诱导分化后7d、14d,Western blot法检测SP-C蛋白表达;(4)在共培养诱导分化体系诱导高表达p130或E2F4的mMSCs分化为AT II后7d、14d,流式细胞法检测各组mMSCs细胞周期的变化;同时,在共培养诱导分化体系诱导mMSCs分化为AT II的基础上,分别加入LiCl或DKK-1,7d及14d后分别检测各组mMSCs细胞周期的变化。结果(1)在共培养诱导分化模型下,高表达p130或E2F4能促进mMSCs向AT Ⅱ分化:在诱导分化后7d、14d,与Control组相比,MSC-p130和MSC-E2F4组SP-C蛋白明显增高(P<0.05);与此同时,荧光显微镜下发现MSC-p130组和MSC-E2F4组SP-C阳性细胞(红色)及DAPI和SP-C双阳性(蓝色与红色融合)数量明显高于Control组;用电镜进一步观察细胞超微结构,与Control组相比,MSC-p130组和MSC-E2F4组诱导分化后的mMSCs胞浆及包膜附近中可见较多的细胞空泡结构,并可见更多的板层小体。(2)在共培养诱导分化模型下,调控经典Wnt信号通路可影响mMSCs向II型肺泡上皮细胞分化:与Control组相比,LiCl活化经典Wnt途径能促进诱导分化后7d及14d SP-C表达上调(P<0.05),而DKK-1抑制该通路后,SP-C的表达较Control组明显减少(P<0.05)。(3)体外诱导分化过程中,调控经典Wnt信号通路可影响mMSCs中p130/E2F4蛋白表达:诱导分化后7d、14d,与Control组相比,LiCl活化经典Wnt途径能促进p-p130、p130及E2F4 表达(P<0.05),而DKK-1 抑制该通路后,p-p130、p130及E2F4的表达较Control组明显降低(P<0.05)。(4)在体外诱导分化过程中,抑制经典Wnt信号通路可影响高表达E2F4的mMSCs向AT II分化,而不能影响高表达p130的mMSCs向ATII分化:在诱导分化后7d、14d,与DKK-1+MSC-NC组相比,DKK-1+MSC-p130组细胞中SP-C表达明显增高(P<0.05),而DKK-1+MSC-E2F4组细胞中SP-C表达无明显变化(P>0.05)。(5)在体外诱导分化过程中,高表达p130或E2F4促进mMSCs向AT II分化可能与G1期延长相关:在诱导分化后7d、14d,MSC-p130组细胞G1期比例明显高于Control组细胞G1期比例(P<0.0001),而MSC-p130组细胞S期比例较Control组明显下降、G2/M期比例明显增加(P<0.0001);并且,与Control组相比,MSC-E2F4组细胞G1期、G2/M期比例亦明显增加(P<0.0001),S期细胞比例明显减少(P<0.0001)。(6)体外诱导分化过程中,调控经典Wnt信号通路影响mMSCs向AT II分化可能与G1+S期的变化相关:在诱导分化后7d,LiCl组细胞G2/M期比例明显低于Control组细胞(P<0.0001),而DKK-1组细胞G2/M期比例较Control组明显升高(P<0.0001);诱导分化后14d,与Control组相比,LiCl组细胞G2/M期比例明显减少(P<0.0001),DKK-1组细胞G2/M期比例明显增加(P<0.0001)。结论经典Wnt信号通路可调控p130或E2F4表达影响mMSCs向II型肺泡上皮细胞分化,其机制与延长mMSCs的G1期相关。第三部分高表达p130/E2F4的MSC移植对ARDS小鼠II型肺泡上皮细胞损伤修复作用的研究目的明确高表达P130/E2F4的mMSCs在ARDS小鼠的肺组织迁移存留及向AT II分化的作用,以及其对修复ARDS小鼠肺损伤的影响。方法C57BL/6小鼠随机分为Control组(正常对照组),ARDS组(LPS造模组),LPS+MSC组(mMSCs细胞治疗组),LPS+MSC-NC组(MSC-NC细胞治疗组),LPS+MSC-p130组(MSC-p130细胞治疗组)和LPS+MSC-E2F4组(MSC-E2F4细胞治疗组),气道内滴入LPS诱导ARDS小鼠动物模型,按分组经不同治疗后7d及14d分别行以下处理:(1)处死小鼠留取肺组织,HE染色行组织病理学检查和肺损伤评分评价肺损伤程度;(2)记录各组小鼠生存只数评价14d病死率(3)近红外成像追踪离体肺中NIR815标记的mMSCs以及免疫荧光染色评价mMSCs在肺组织中的存留;(4)免疫荧光染色共定位肺SP-C及Western blot检测肺组织中表面活性蛋白A(surfactant protein A,SP-A)、SP-C表达水平评价mMSCs在肺组织中向ATII细胞分化;(5)计算肺湿重/体重比(LWW/BW)评价肺水肿程度;(6)留取肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF),ELISA法检测总蛋白(totalprotein,TP)和白蛋白(albumin,ALB)水平评价肺上皮通透性;(7)Western blot检测肺组织中occludin表达水平评价mMSCs对肺上皮细胞紧密连接的修复作用;(8)利用5%BSA的PBS行BAL,测定BALF中蛋白的吸光度,计算肺泡液体清除率(alveolar fluid clearance,AFC);(9)Masson染(?)结果(1)高表达p130或E2F4能促进mMSCs减轻ARDS小鼠肺组织病理损伤。大体病理结果显示,LPS诱导复制ARDS小鼠模型后7d、14d,LPS+MSC组与LPS+MSC-NC组小鼠肺损伤无明显差异,但较ARDS组小鼠肺损伤(充血、水肿及出血点)显著减轻,LPS+MSC-p130和LPS+MSC-E2F4组较LPS+MSC-NC组小鼠肺损伤程度减轻更明显;组织病理结果显示,LPS诱导复制ARDS小鼠模型后7d、14d,LPS+MSC组和LPS+MSC-NC组小鼠肺组织病理损伤程度(水肿、出血、炎性细胞浸润)较ARDS组显著减轻,LPS+MSC-p130组和LPS+MSC-E2F4组较LPS+MSC-NC组小鼠肺组织病理损伤程度减轻更明显;肺组织病理损伤评分结果显示,LPS+MSC和LPS+MSC-NC组7d、14d小鼠肺组织病理损伤评分较ARDS组明显减轻(P<0.05),而与LPS+MSC-NC组相比,LPS+MSC-p130组和LPS+MSC-E2F4组小鼠肺组织病理损伤评分显著降低(P<0.05)。(2)LPS诱导复制ARDS小鼠模型后14d,ARDS组病死率为55.6%,LPS+MSC和LPS+MSC-NC组病死率分别为41.2%、35.3%,较ARDS组无明显差异(P>0.05),但有下降趋势,LPS+MSC-p130组和LPS+MSC-E2F4组病死率较LPS+MSC-NC组无显著差异(P>0.05),但有更进一步下降趋势。(3)高表达p130或E2F4增加mMSCs在LPS诱导的ARDS小鼠肺组织的存留。LPS诱导后7d和14d进行小鼠离体肺的近红外成像,经过颜色编码的荧光图像分析发现,7d时LPS+MSC-p130组及LPS+MSC-E2F4组小鼠离体肺荧光数量明显高于LPS+MSC-NC组(P<0.05);14d时LPS+MSC-p130组及LPS+MSC-E2F4组小鼠离体肺荧光数量较LPS+MSC-NC组有增加趋势,但四个实验组之间荧光数量无统计学差异(P>0.05)。LPS诱导后7d和14d对小鼠肺组织进行免疫荧光染色,荧光显微镜下观察发现,LPS+MSC-p130组和LPS+MSC-E2F4组小鼠肺组织内GFP阳性细胞数量明显高于LPS+MSC-NC组。(4)高表达p130或E2F4促进mMSCs在LPS诱导的ARDS小鼠肺内向AT II分化。LPS诱导后7d和14d,取小鼠肺组织进行免疫荧光染色,荧光显微镜下发现LPS+MSC-p130组和LPS+MSC-E2F4组小鼠肺组织内GFP和SP-C双染阳性细胞数量明显高于LPS+MSC-NC组;Western blot法检测发现LPS+MSC和LPS+MSC-NC组肺组织SP-A、SP-C蛋白明显高于ARDS组(P<0.05),而LPS+MSC-p130组和LPS+MSC-E2F4组SP-A、SP-C蛋白表达明显高于LPS+MSC-NC组(P<0.05)。(5)高表达p130或E2F4的mMSCs改善LPS诱导的ARDS小鼠肺通透性。LPS诱导复制ARDS小鼠模型后 14d,LPS+MSC-p130组和LPS+MSC-E2F4 组LWW/BW较LPS+MSC-NC组显著降低(P<0.05),BALF中TP和ALB浓度也较LPS+MSC-NC组明显降低(P<0.05);LPS诱导复制ARDS小鼠模型后7d、14d,LPS+MSC-p130组和LPS+MSC-E2F4组小鼠肺组织中occludin蛋白的表达较LPS+MSC-NC组显著增加(P<0.05);LPS诱导复制ARDS小鼠模型后7d,LPS+MSC-p130组和LPS+MSC-E2F4组小鼠AFC较LPS+MSC-NC组有增加趋势,但无明显差异(P>0.05);至14d时,LPS+MSC-p130组和LPS+MSC-E2F4组小鼠AFC较LPS+MSC-NC组显著增高(P<0.05)。(6)高表达p130或E2F4的mMSCs可减轻LPS诱导的ARDS小鼠肺纤维化。LPS诱导后14d小鼠肺纤维化评分LPS+MSC-p130组与LPS+MSC-E2F4组较LPS+MSC-NC组明显降低(P<0.05)。结论高表达p130或E2F4能增加mMSCs在ARDS小鼠肺组织存留,并通过促进mMSCs向AT Ⅱ分化,从而改善肺上皮通透性、减轻肺水肿程度并增强mMSCs改善肺纤维化的作用,更进一步促进mMSCs修复ARDS肺损伤。