星形胶质细胞(Astrocyte)是神经系统中数目众多的细胞之一,在神经系统中不但起着支持、营养、保护的作用,而且还表现调节神经元生长,神经递质传递,神经元突触电活动等诸多重要生物学功能。神经胶质细胞功能的异常可以直接导致神经系统功能的异常,许多中枢神经系统退化性疾病和损伤性疾病如阿尔兹海默病,帕金森综合征,脑缺血后神经功能损害程度等都与星形胶质细胞活化及功能活动异常有关。　　 近年来,中枢神经系统损伤后的修复一直是科研人员和临床工作者关注的重点。神经干细胞移植已成为神经退化性疾病及神经系统缺血损伤的一种尝试性试验治疗手段。众多行为学试验表明移植神经干细胞后,损伤的神经系统功能有一定程度的改善,形态学研究结果表明移植的部分神经干细胞可以在脑内发育成星形胶质细胞,其对神经功能的改善可能发挥着一定的影响。但是由于神经干细胞来源的复杂性,因此,对神经干细胞种类、移植时间的选择,对移植的细胞如何进行有效诱导使其分化为目的细胞及其修复机制的探讨仍是此类研究的瓶颈。神经胶质细胞来自于神经胶质祖细胞,神经胶质祖细胞又由神经干细胞分化而来。目前关于神经胶质祖细胞对神经系统结构和功能重建作用的相关报道仍不充分星形胶质细胞可以通过释放ATP,D-丝氨酸,肿瘤坏死因子等生物活性物质来调节突触的数量,突触的反应强度及突触间神经递质的传递。基于以上信息,我们感兴趣的是:经细胞移植后分化存活的星形胶质细胞是否会影响突触的功能及其可能的机制。　　 本课题利用将人神经胶质祖细胞移植到正常小鼠脑内两侧侧脑室周区的动物模型,应用多种实验方法观察分化的人星形胶质细胞的形态特点,观察人星形胶质细胞的生理学特性,观察人星形胶质细胞对小鼠海马齿状回突触活动的影响。为探讨星形胶质细胞的结构发育与功能特点提供体内实验依据。　　 材料和方法：　　 一、主要试剂：来自于17—22周的流产人胚的前脑脑室下区的神经胶质祖细胞(A2B5细胞)和CMV-绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,EGFP)逆转录病毒由美国罗切斯特大学的Goldman教授惠赠；小鼠抗人核单克隆抗体,小鼠抗人NG2单克隆抗体,兔抗A2B5多克隆抗体(Chemicon,美国),小鼠抗人神经胶质酸性蛋白Hgfap单克隆抗体(Sternberger公司,美国),小鼠抗人线粒体单克隆抗体(USBiological公司,美国),兔抗D-丝氨酸多克隆抗体,鸡抗层粘连蛋白多克隆抗体(Abcam公司,美国),小鼠抗NMDARI单克隆抗体,(Sternberger公司,美国),羊抗人肿瘤坏死因子多克隆抗体(R&D systems,美国),羊抗丝氨酸消旋酶多克隆抗体(Santa Cruz,美国),DAPI核DAPI核染色剂和Cy3或Cy5荧光标记的二抗(Jackson公司,美国)　　 二、主要仪器：细胞培养箱和超净台(Erlab,美国)；共聚焦显微镜和Fluview300图像分析系统((Olympus,日本)；荧光倒置显微镜(Olympus,日本)；恒温冷冻切片机(Leiea,德国)；-80℃深低温冰箱(Toshiba,日本)；立体定位微注射仪(USEquipment Co,美国)；双光子激光显微镜(Olympus,日本)；紫外线激光发生器(US Equipment Co,美国)；电生理描记系统(US Equipment Co,美国)；震荡切片机(Leica,德国)；行为学实验记录箱(Coulboum Instruments,美国)。　　 三、实验方法：　　 1、实验动物：实验动物为新生24h以内的Rag2小鼠60只,雌雄不限,购自美国Jackson实殓室。随机分为两组:实验组和对照组。　　 2、神经胶质祖细胞的培养和转染：A285细胞用DMEM/F12/N1无血清培养基培养,其内加入20ng/ml Bfgf。转染按文献的方法进行,将细胞与CMV-EGFP逆转录病毒孵育过夜,弃上清,用DMEM/F12/N1培养液继续培养3-5天。用荧光倒置显微镜观察,转染成功的A285细胞(表达绿色荧光蛋白)用于移植实验。　　 3、神经胶质祖细胞的移植:转染后的A285细胞用胰蛋白酶消化,吹打细胞悬浮于HBSS中。将出生24h内的Rag2小鼠冰上麻醉后,固定于立体定位仪上,用玻璃微量加样器将1ul(1×105/ul)的细胞悬液平均注入两侧侧脑室周区。　　 4、免疫组织化学:染色观察细胞形态结构。　　 5、膜片钳方法记录胶质细胞电生理特性：将400微米厚的脑片置于双光子激光显微镜下,用膜片钳方法记录人神经胶质细胞的形态,膜电位,细胞阻抗等生理指标。用膜片钳方法向细胞内注入钙指示剂(rhod2)与钙蝥合剂(NP-EGTA),用紫外激光激发钙释放,双光子显微镜下观察钙波传导,测量钙波传导速度[42]。　　 6、电生理LTP实验：选取含海马齿状回的脑片进行记录兴奋性突触后电位和长时程增强效应实验。在海马齿状回的颗粒下区(苔藓纤维)放置记录电极和刺激电极。　　 7、TNFa抑制剂给药方法：小鼠在进行电生理实验前10天起,每天给予Thalidomide腹腔注射(500mg/kg,I.p,0.25-0.3 ml)。　　 8、行为学实验：关于学习和记忆的行为学实验在两个记录箱中进行。第一个记录箱用于训练动物,第二个记录箱用于检测和录像记录。小鼠在箱内适应3分钟后,给予长达30秒420HZ的声音刺激,在声音刺激结束后,给予2秒钟0.3mA的电流刺激足部。实验结果用Freezeview software软件进行分析9、统计学处理所有数据采用mean±SD表示,用Sigma stat8.0统计软件对数据进行方差分析,差异显著性采用t检验。P＜0.05为差异有显著性。　　 结果：　　 1、细胞培养观察神经胶质祖细胞的转染细胞成功表达绿色荧光蛋白。转染并培养5天后,细胞分化为扁平梭形多突起的细胞,A2B5免疫荧光染色为阳性。　　 2、神经胶质祖细胞的分布移植6个月后,可见分化的神经胶质祖细胞主要分布于皮层,胼胝体,海马和侧脑室周围,细胞表达绿色荧光蛋白。　　 3、神经胶质祖细胞的分化和细胞结构特点免疫荧光染色结果表明,移植后的细胞主要分化成星形胶质细胞,并体现人星形胶质细胞的结构特点:细胞大,突起多,突起长,线立体沿细胞长突起排列,突起末端与血管接触。海马中可见Hng2表达阳性的细胞。　　 4、人星形胶质细胞的生理学特性与鼠星形胶质细胞相比,人星形胶质细胞细胞阻抗略高,静息膜电位无统计学差别。紫外激光激发实验显示钙波可沿人星形胶质细胞的长突起传递,人星形胶质细胞钙波传导速度比鼠星形胶质细胞快。　　 5、Fepsp和LTP实验在不同的强度刺激下,实验组的Fepsp明显高于对照组。LTP实验结果显示HFS后,实验组的Fepsp反应可持续60分钟,而对照组回到基线。两者的差别有统计学意义。　　 6、免疫染色分析TNFa和GluRl的表达实验组的TNFa和Glugl的表达均高于对照组,而NRl的表达在两者并无明显区别。注射Thalidomide后,实验组TNFa和GluRl的表达均低于对照组,NRl的表达在两者并无明显区别。　　 7、行为学实验分析学习记忆能力的差异实验组的小鼠学习和记忆的能力明显高于对照组。　　 结论：　　 1、将人神经胶质祖细胞移植入正常小鼠脑内两侧侧脑室周区后,细胞在移植部位存活、分化、增殖并体现人星形胶质细胞的形态结构特点。　　 2、分化的人星形胶质细胞可能参与了宿主脑内血脑屏障的形成。　　 3、分化的人星形胶质细胞表达人细胞的电生理学特性,钙波传导速度比鼠星形胶质细胞快。　　 4、人星形胶质细胞加强了小鼠海马齿状回神经元的突触活动,主要表现在兴奋性突触后电位和长时程增强效应的加强。　　 5、小鼠海马齿状回TNFa表达的增加可能是促进长时程增强效应的主要的影响因素。