木聚糖作为一种几乎存在于所有植物的细胞壁中的多聚五碳糖,是自然界中第二大可再生资源——半纤维素的重要组分。木聚糖酶能够水解木聚糖产生寡聚木糖、少量的木糖、甘露糖及阿拉伯糖,在食品、农业、功能性低聚木糖生产、造纸、纺织、能源等行业均有着可观的应用前景。然而,工业生产中普遍存在的极端环境如高温、高压、极端pH等条件限制了商业化木聚糖酶的活性,导致它们的应用范围受到极大限制,亟需研究者通过各种分子改造手段对野生型木聚糖酶进行改造,使其满足工业生产应用的要求。前期本实验室通过鸟枪法克隆到一个木聚糖酶基因xynHB来源于Bacillus pumilus HBP8并在毕赤酵母进行诱导表达。检测其酶学性质显示,该酶pH范围为5-9.8,反应温度为40-60℃,但该蛋白在60℃下热稳定性较差,半衰期仅有12min,随后通过定点诱变的方法,将该木聚糖酶的第三个糖基化位点第188位的N突变成A,意外得到热稳定性显著提高的突变体XynHBN188A将其命名为XynHBN3,后续实验基于XynHBN3对其进行分子改造。本研究首先利用PyMol、MODELLER、VMD等辅助软件对木聚糖酶XynHBN3的三级结构进行分析后对碱性木聚糖酶XynHBN3进行理性设计,推测出两种方案:1)将第167位的丝氨酸S突变成精氨酸R;2)将第41位的天冬酰胺N突变成精氨酸R;于是设计突变引物进行定点诱变,研究其蛋白突变对其结构和功能的影响。在第一方案中,将第167位的丝氨酸S突变成精氨酸R,获得突变体后,分别将原始基因和突变基因xynHBN3S167R在大肠杆菌Rosetta（DE3）进行诱导表达,随后对表达产物进行了镍柱亲和层析法,最后再比较木聚糖酶原始蛋白XynHBN3和突变体XynHBN3S167R的酶学性质,研究发现,获得的突变体pH稳定性由原来的30%-50%上升到90%,大幅度提高;在第二方案中,将第41位的天冬酰胺N突变成精氨酸R获得突变体后同样诱导表达纯化,对其酶活性进行了初步研究发现,获得的突变体和原始蛋白相比较没有较大变化。另一方面采用易错PCR的定向进化技术对xynHBN3基因进行随机突变,突变的PCR产物与载体pET-28a构建重组表达质粒,电转入大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞构建突变文库。得到的突变体库的突变率分别为2.05%和3%,采用点交联木聚糖底物平板观察水解圈的方法过对近2万个重组子的筛选,几轮粗筛后筛选出10个菌株,后进行第二轮摇瓶发酵复筛,得到一株比酶活提高了 2.8倍的突变体XynHBN3217。测序分析表明木聚糖酶基因xynHBN3217突变了 4个位点,第105 A突变为G,第124位A突变为G,第153位A突变为G,第445位A突变为T,造成两个氨基酸突变:第42位天冬酰胺N突变为天冬氨酸D,第149位苏氨酸T突变为S丝氨酸。为了进一步得到pH稳定性更高的突变体,我们同时将理性设计方案一中的位点S167R与XynHBN3217结合,将xynHBN3217基因的第167位氨基酸丝氨酸S突变成精氨酸R研究其酶学性质,发现该累积突变体比酶活比XynHBN3217低,比XynHBN3高。为深入研究xynHBN3217两个氨基酸突变位点对其蛋白结构及活性的影响,我们分别将两个突变位点进行饱和诱变,通过底物平板筛选初步得到三个水解圈更大的突变体。