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为了探究玉米胚粕发酵生产谷胱甘肽的能力,本研究以玉米胚粕为培养基原料,为使玉米胚粕可以达到碳源标准,首先对玉米胚粕进行粉碎与糖化,以DE值为指标,对料液比、糖化时间、糖化酶添加量、糖化温度进行单因素试验与正交试验,得到最佳糖化工艺使玉米胚粕糖化液DE值达到90以上。将新型培养基与两种不同酵母菌培养基进行对比,选取培养菌落数最多的培养基为本研究培养基。以谷胱甘肽产量为标准,将酿酒酵母L5267、酿酒干酵母与贝酵母进行比较,选取谷胱甘肽产量最高的菌种作为本研究的试验菌种。确定培养基成分后对其中的硫酸铵、半胱氨酸、肌醇、磷酸二氢钾进行单因素试验与响应面实验,以谷胱甘肽产量为标准得到最佳工艺条件。选取常见的铜盐法、离子交换树脂与反胶束萃取三种谷胱甘肽提取方法进行对比,以提取率为指标选择最佳谷胱甘肽提取方式进行单因素与响应面实验,得到最佳提取工艺条件。分离纯化谷胱甘肽后以谷胱甘肽标准品为标准进行抗氧化实验(ABTS、DPPH、OH-清除试验)与小鼠体内实验(抗疲劳、醒酒实验),通过比较研究发酵生产谷胱甘肽的品质,结果如下。
(1)糖化工艺通过单因素试验与正交试验后,最终得出最佳料液比为1∶4,最佳糖化温度为53℃,最佳糖化时间为49h,最佳糖化酶添加量为275u/g,最终测得玉米胚粕糖化液DE值最高平均值达到了94,达到了培养基碳源标准。
(2)通过比较三种菌种生产谷胱甘肽的能力选择出酿酒酵母L5267为本研究试验菌种,通过培养基发酵能力对比实验选择新型培养基作为本研究培养基。通过单因素试验与响应面实验选取最优添加量为铵添加量1.435g/L、肌醇添加量0.108g/L、半胱氨酸添加量0.44g/L、磷酸二氢钾添加量0.213g/L。通过验证试验得知此工艺条件培养基中谷胱甘肽含量可达到459.209mg/L,与预测结果相差0.4%,比单因素最高结果提高了12.07%。
(3)通过单因素试验与响应面实验得出AOT最佳添加量为43.2g/L、W0最佳值为24.05、K+最佳添加量为0.438mol/L。通过验证试验得知AOT-异辛烷反胶束萃取率最高达到了90.006%,与预测结果相差0.02%,比单因素实验结果提高了9.6%。
(4)自由基清除试验中,ABTS清除能力大小为谷胱甘肽标品(IC50=0.0051mg/mL)>玉米胚粕谷胱甘肽(IC50=0.0068mg/mL)>抗坏血酸(IC50=0.025mg/mL),DPPH清除能力大小为抗坏血酸(IC50=0.022mg/mL)>谷胱甘肽标品(IC50=0.028mg/mL)>玉米胚粕谷胱甘肽(IC50=0.028mg/mL),·OH清除能力大小为谷胱甘肽标品(IC50=0.11mg/mL)>玉米胚粕谷胱甘肽(IC50=0.15mg/mL)>抗坏血酸(IC50=0.23mg/mL),谷胱甘肽有着良好的自由基清除能力。
(5)小鼠抗疲劳试验中,灌喂高剂量(0.8g/kg)谷胱甘肽标准品的小鼠血液中多巴胺浓度最高可达到0.372ng/mg,而灌喂高剂量(0.8g/kg)玉米胚粕谷胱甘肽的小鼠血液中多巴胺浓度最高达到0.358ng/mg,谷胱甘肽对小鼠具有一定的抗疲劳作用。
(6)醒酒实验中,谷胱甘肽标准品中剂量(0.2mg/20g)灌喂组酒精浓度降低了64.9%,醒酒时间提前26.3min;高剂量组(0.3mg/20g)酒精浓度降低了75.8%,醒酒时间提前了与38.0min;玉米胚粕谷胱甘肽,高剂量(0.3mg/20g)灌喂组酒精浓度降低了65.64%,醒酒时间提前30.7min,谷胱甘肽样品有着明显的醒酒护肝效果。
(1)糖化工艺通过单因素试验与正交试验后,最终得出最佳料液比为1∶4,最佳糖化温度为53℃,最佳糖化时间为49h,最佳糖化酶添加量为275u/g,最终测得玉米胚粕糖化液DE值最高平均值达到了94,达到了培养基碳源标准。
(2)通过比较三种菌种生产谷胱甘肽的能力选择出酿酒酵母L5267为本研究试验菌种,通过培养基发酵能力对比实验选择新型培养基作为本研究培养基。通过单因素试验与响应面实验选取最优添加量为铵添加量1.435g/L、肌醇添加量0.108g/L、半胱氨酸添加量0.44g/L、磷酸二氢钾添加量0.213g/L。通过验证试验得知此工艺条件培养基中谷胱甘肽含量可达到459.209mg/L,与预测结果相差0.4%,比单因素最高结果提高了12.07%。
(3)通过单因素试验与响应面实验得出AOT最佳添加量为43.2g/L、W0最佳值为24.05、K+最佳添加量为0.438mol/L。通过验证试验得知AOT-异辛烷反胶束萃取率最高达到了90.006%,与预测结果相差0.02%,比单因素实验结果提高了9.6%。
(4)自由基清除试验中,ABTS清除能力大小为谷胱甘肽标品(IC50=0.0051mg/mL)>玉米胚粕谷胱甘肽(IC50=0.0068mg/mL)>抗坏血酸(IC50=0.025mg/mL),DPPH清除能力大小为抗坏血酸(IC50=0.022mg/mL)>谷胱甘肽标品(IC50=0.028mg/mL)>玉米胚粕谷胱甘肽(IC50=0.028mg/mL),·OH清除能力大小为谷胱甘肽标品(IC50=0.11mg/mL)>玉米胚粕谷胱甘肽(IC50=0.15mg/mL)>抗坏血酸(IC50=0.23mg/mL),谷胱甘肽有着良好的自由基清除能力。
(5)小鼠抗疲劳试验中,灌喂高剂量(0.8g/kg)谷胱甘肽标准品的小鼠血液中多巴胺浓度最高可达到0.372ng/mg,而灌喂高剂量(0.8g/kg)玉米胚粕谷胱甘肽的小鼠血液中多巴胺浓度最高达到0.358ng/mg,谷胱甘肽对小鼠具有一定的抗疲劳作用。
(6)醒酒实验中,谷胱甘肽标准品中剂量(0.2mg/20g)灌喂组酒精浓度降低了64.9%,醒酒时间提前26.3min;高剂量组(0.3mg/20g)酒精浓度降低了75.8%,醒酒时间提前了与38.0min;玉米胚粕谷胱甘肽,高剂量(0.3mg/20g)灌喂组酒精浓度降低了65.64%,醒酒时间提前30.7min,谷胱甘肽样品有着明显的醒酒护肝效果。