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脊髓损伤后,神经功能很难恢复的重要原因之一是神经元与轴突缺乏强有力的神经营养因子促进其功能恢复,神经元坏死与凋亡,中枢神经内环境内抑制因素导致轴突生长困难,从而使脊髓损伤的治疗效果不明显。胶质细胞源性神经营养因子(glial cell-line derived neurotrophic factor(GDNF))是近年发现的能够促进多种神经细胞存活,在神经系统发育、分化和损伤修复中具有非常重要作用的一种神经营养因子。GDNF不仅促进多巴胺能神经元的存活和分化,而且能够促进运动神经元的存活和分化.脊髓损伤后加入GDNF可以明显促进轴突生长,阻止受损神经元的进一步坏死与凋亡,抑制胶质瘢痕的形成等。胶质细胞源性神经生长因子(GDNF)是功能强大的轴突生长促进因子,GDNF家族对调节运动神经轴突的生长和分枝发挥了重要功能,体外试验发现GDNF可以明显提高运动轴突的生长,有学者将GDNF基因在体外转移到受体细胞如雪旺氏细胞,神经干细胞等,再将受体细胞转移到脊髓损伤部位进行基因修饰的细胞移植,促进抑制细胞存活与分化。[实验目的]本实验主要目的是构建pcDNA3.1/GDNF真核表达载体,为GDNF基因在体外转移到受体细胞如雪旺氏细胞,再将受体细胞转移到脊髓损伤部位进行基因修饰的细胞移植,促进抑制细胞存活与分化,为治疗脊髓损伤提供理论基础。[实验方法]应用Trizol试剂盒从新生大鼠肾组织中提取总RNA,并进行质量测定,确定RNA纯度和含量。用逆转录聚合酶链式反应获得并扩增GDNF全长cDNA,经过聚合酶链式反应后,构建其真核表达载体pcDNA3.1/GDNF,琼脂糖凝胶电泳检测逆转录聚合酶链式反应效果,连接pcDNA3.1/GDNF转化感受态受体菌DH5α,并进行测序鉴定。[实验结果]成功从新生大鼠肾组织中提取到总RNA,并经电泳证实提出的RNA质量与纯度良好,适于逆转录反应模板。为构建质粒pcDNA3.1/GDNF做好准备,利用逆转录聚合酶链式反应成功复制并扩增GDNF的cDNA。通过基因克隆,获得大量质粒pcDNA3.1/GDNF,为进一步用于脊髓损伤的实验研究做好准备。[结论]本实验结果提示:成功构建带有真核启动子的胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)真核表达载体,为下一步转基因应用到脊髓损伤后的治疗奠定了基础。