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研究背景：GRIM-19(Gene associated with Retinoid-Interferon-induced Mortality19,干扰素/维甲酸联合应用诱导细胞凋亡相关基因19)是Kalvakolanu用反义RNA敲除技术在乳腺癌细胞筛选鉴定并首先报道的凋亡蛋白。GRIM-19定位于19p13·2,其编码含144个氨基酸残基的蛋白质,分子量约16KD。GRIM-19定位于细胞核、细胞质、线粒体。GRIM-19的过度表达激活细胞的凋亡过程,其表达降低或位点突变可以导致细胞的异常增殖和恶性转化。同时,GRIM-19又是线粒体呼吸链中NADH脱氢酶复合体Ⅰ的基本亚单位,在呼吸过程中起着重要的作用。STAT3(Signal transducer and activator of transcription-3)是一种存在于细胞浆与酪氨酸磷酸化信号通道偶联的双功能蛋白。研究表明STAT3在多数肿瘤中处于持续激活状态,并上调抗凋亡基因的表达。GRIM-19是STAT3表达和激活的阴性调节因子,能够下调STAT3及其下游靶基因的表达,继而参与肿瘤细胞的凋亡。研究目的：通过分析GRIM-19及其靶基因产物STAT3在乳腺癌组织与癌旁组织中的表达情况,探讨(GRIM-19及STAT3在乳腺癌中的表达及相关性。研究方法：选择山东大学齐鲁医院2011年7月-2013年9月收治的93例乳腺癌患者的癌组织及癌旁组织。年龄39-65岁,中位年龄为48.5岁。标本采集后,立即置入液氮冷冻,然后转入-80℃冰箱备用。其中,采用Western blot、免疫组织化学(SP法)检测2011年7月-2012年1月所收集20组标本中GRIM-19、STAT3蛋白的表达。应用RT-PCR检测2013年4月-2013年9月收集的73组标本中GRIM-19、STAT3mRNA的表达。同时,统计患者的临床病理学指标,包括ER、PR、HER-2/neu、Ki-67、P53等。所有诊断均经病理检查证实。1、Western blot检测步骤：适量组织加入50μl RIPA(临用前加入PMSF、抑蛋白酶肽)冰上30min,4℃12000rpm/min离心10min,移上清至一新的微量离心管,蛋白定量后进行SDS-PAGE电泳,再电转至IJPVDF膜上,用5%脱脂奶粉配制(?)1×TBST20℃封闭2h,GRIM-19一抗按1:500反应4℃过夜,TBST洗膜10min×3次,GRIM-19二抗按1：1500反应2h,TBST洗膜10min×3次；STAT3一抗按1:5000反应4℃过夜,TBST洗膜10min×3次。STAT3二抗按1:2000反应2h,TBST洗膜10min×3次；β-actin一抗按1:1500反应4℃过夜,TBST洗膜10min×3次,β-actin二抗按1：1500反应2h,TBST洗膜10min×3次。ECL显影并处理图像。2、免疫组化检测(1)免疫组化过程将收集到的乳腺癌组织及癌旁组织应用甲醛溶液固定,石蜡包埋,4μm连续切片；脱蜡水化,3%过氧化氢浸泡10min,微波修复(GRIM-19采用pH6.0柠檬酸,STAT3采用pH8.0EDTA),中高火10min,中低火10min,冷却至室温；滴加血清封闭,37℃孵育30min,后滴加一抗,37℃孵育90min,磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后滴加生物素标记的二抗,37℃孵育20min,冲洗,滴加链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物工作液,37℃孵育20min,冲洗后DAB法显色,复染封片。一抗试剂选用Santa Cruz公司鼠抗人多克隆抗体GRIM-19(sc-99086,1:100dilution. Santa Cruz, CA)、兔抗人单克隆抗体STAT-3(Cell Signaling Technology,1:100dilution. Beverly, MA)、二硝基联苯胺(DAB)显色剂购自Santa Cruz, CA。STAT3阳性对照采用已经报道过表达阳性的肺鳞癌组织,GRIM-19(?)日性对照采用正常人的胰岛组织。阴性对照用PBS代替一抗。(2)免疫组化评分标准GRIM-19和STAT3免疫组化阳性标准,根据组织细胞中阳性细胞所占比例以及染色深度进行综合评分。按照阳性细胞百分比进行评分：阳性细胞所占比例为随机选取5个视野,分别计数100个细胞。阳性细胞≤10%记为0分,11%-25%为1分,>25%-50%为2分,>50%为3分。染色深度：无色为0分,浅黄色为1分,棕黄色为2分,黄褐色为3分。两个评分标准的乘积作为该标本的积分,≤2分为阴性,>2分为阳性。3、Real-time PCR检测(1)组织的获取与裂解用生理盐水将组织标本冲洗1-2次,用TRIZOL法提取mRNA,并测定mRNA浓度。(2)逆转录配置逆转录体系,混匀,反应条件：第一步,37℃20min；第二步,85℃5s；第三步,4℃forever;第四步,stop。(3)Real Time PCR(20μl体系)10μl SYBR,0.2μl PCR F Primer,0.2μl PCR R Primer,2.0μl cDNA模板,7.6μl3dw灭菌。反应条件：95℃30s, Holding stage;95℃5s,55.0℃30s,39cycles;95.0℃15s,60.0℃1min,90℃15s, Melt curve stage。研究结果：一、GRIM-19与STAT3在乳腺癌组及癌旁组中的表达水平及相关性1、Western blot检测结果显示GRIM-19与STAT3蛋白在乳腺癌组织及癌旁组织中均有表达,但GRIM-19蛋白在乳腺癌组中的表达低于癌旁组织(P<0.001);STAT3蛋白在乳腺癌组中的表达高于癌旁组(P<0.001)。且在90%(18/20)患者的乳腺癌组织中,同时呈现GRIM-19蛋白的低表达与STAT3蛋白的高表达,两者蛋白表达呈负相关(r=-0.68,P<0.001)。2、免疫组化(SP法)检测结果显示GRIM-19蛋白在乳腺癌组中的阳性率低于癌旁组(x=12.13,P<0.001)。STAT3蛋白在乳腺癌组中的阳性率高于癌旁组(x2=4.91,P=0.027)。且在65%(13/20)患者的乳腺癌组织中,同时呈现GRIM-19蛋白的低表达与STAT3蛋白的高表达,两者蛋白表达呈负相关(r=-0.49,P=0.028)。3、RT-PCR检测结果显示GRIM-19与STAT3mRNA在乳腺癌组织及癌旁组织中均有表达,但GRIM-19mRNA在乳腺癌组中的表达低于癌旁组(P<0.001)：STAT3mRNA在乳腺癌组中的表达高于癌旁组(P<0.001)。且在68%(50/73)患者的乳腺癌组织中,同时呈现GRIM-19mRNA的低表达与STAT3mRNA的高表达,两者mRNA表达呈负相关(r=-0.60,P<0.001)。二、乳腺癌组织中GRIM-19与STAT3的表达水平与病理学指标的关系1、分析乳腺癌组织中GRIM-19与STAT3蛋白在Western blot方法中的检测结果与病理学指标的关系,结果显示HER-2/neu阳性组中GRIM-19蛋白的表达低于HER-2/neu阴性组(P=0.037),ER阳性组中STAT3蛋白的表达高于ER阴性组(P=0.030)。2、分析乳腺癌组织中GRIM-19与STAT3mRNA的表达与病理学指标的关系,结果显示：(1)GRIM-19mRNA在乳腺癌组织学分级Ⅲ级组中高表达率低于Ⅰ/Ⅱ级组(P=0.026)；同时,Ⅲ级组中STAT3的mRNA高表达率高于Ⅰ/Ⅱ级组(P=0.021)。(2)GRIM-19mRNA的表达与Ki-67呈负相关(r=-0.414,P<0.05),即GRIM-19mRNA表达降低时,Ki-67阳性率升高；相反,STAT3mRNA的表达与Ki-67呈正相关(r=0.898,P<0.05),STAT3mRNA表达升高时,Ki-67阳性率也升高。(3)STAT3mRNA在腋窝淋巴结阳性组中的高表达率高于腋窝淋巴结阴性组(P=0.024)。结论：乳腺癌组织中GRIM-19的蛋白、mRNA呈低表达,而STAT3均呈高表达,且两者均呈负相关。GRIM-19表达降低可能导致其对STAT3的调控作用减弱,参与乳腺癌的发生、进展。