论文部分内容阅读
目的:丙烯酰胺（acrylamide,ACR）进入体内后,经 CYP2E1（Cytochrome P4502E1,CYP2E1）代谢转化为环氧丙酰胺（glycidamide,GA）。有研究表明,在肌肉和神经组织中存在较高浓度的ACR原型和代谢产物GA。考虑到GA的生物效应,对ACR神经毒作用的研究不能仅仅关注其物质原型,应进一步同时探究其代谢产物GA在此过程中产生的毒效应机制及作用差异。通过以高/低表达目的代谢酶CYP2E1的人源肝细胞HEPG2 E47/C34与可分化为成熟神经元的神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y体外共培养模型为基础,构建ACR在体代谢微环境的体外平台,研究ACR的神经突触可塑性损伤效应,揭示ACR原型及其主要代谢产物GA对神经毒效应的作用机制和差异。方法:1 HepG2 E47和HepG2 C34细胞株的构建及验证:构建pWSLV-07-cyp2e1过表达质粒及未插入cyp2e1基因片段的pWSLV-07空载质粒,扩增并收集重组质粒,将上述质粒转染293T细胞。以含不同质粒的病毒液侵染HepG2细胞,嘌呤霉素筛选后挑选目的单克隆细胞进行培养与扩增。应用荧光定量RT-PCR及Western blot法在mRNA与蛋白水平检测CYP2E1 在HepG2 E47、HepG2 C34 和HepG2中的表达水平,验证目的细胞株的构建。2 HepG2 E47/SH-SY5Y 与HepG2 C34/SH-SY5Y 共培养模型的建立及ACR的神经元损伤效应研究:将对数生长期的SH-SY5Y接种6孔板;HepG2 E47/C34分别接种至Transwell共培养系统小室,构建HepG2 E47/SH-SY5Y与HepG2 C34/SH-SY5Y共培养系统。①CCK-8法检测ACR梯度剂量（0、50、100、150、200、250和50μg/ml）下不同染毒时间（24、48和72h）对单培养SH-SY5Y细胞相对存活率的影响;②将HepG2 E47、HepG2 C34与SH-SY5Y细胞采用间接共培养方式,Transwell上室培养HepG2 E47或HepG2 C34,下室培养SH-SY5Y,CCK-8 法检测ACR梯度剂量（0、50、100、150、200、250 和 500μg/ml）24h时点对两组共培养系统中SH-SY5Y细胞相对存活率的影响。HPLC法检测两组共培养系统经ACR染毒后（0、50、100和150μg/ml,24h）的ACR物质原型及其主要代谢产物GA的含量。3 ACR及其代谢产物GA对两组共培养系统中的神经突触结构和功能可塑性损伤效应研究:ACR（0、50、100和150μg/ml,24h）染毒处理两组共培养系统后,电镜检测两组共培养体系中神经细胞突触和线粒体的微观结构变化;化学比色法检测Ca2+-ATPase和Na+-K+ATPase的酶活性变化;Western blot法检测突触前可塑性关键功能蛋白突触素Ⅰ（Synapsin Ⅰ）、生长相关蛋白-43（growth associated protein43,GAP-43）和可溶性N-甲基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（soluble N-ethylmaleimide-sensititve factor attachment protein receptor proteins,SNAREs复合体）各个蛋白（SNAP25、Syntaxin 1A、VAMP-2）的表达水平变化。结果:1 HepG2 E47和HepG2 C34细胞株的构建及验证:HepG2 E47的cyp2e1mRNA表达显著高于与HepG2、HepG2 C34组,差异有统计学意义（P<0.05）;HepG2与HepG2 C34组比较,cyp2e1的表达未见统计学差异（P>0.05）。HepG2 E47的CYP2E1蛋白表达显著高于HepG2、HepG2 C34组,差异有统计学意义（P<0.05）;HepG2与HepG2 C34组比较,CYP2E1的蛋白表达量未见统计学差异（P>0.05）。2 HepG2 E47/SH-SY5Y 与 HepG2 C34/SH-SY5Y 共培养模型的建立及ACR 的神经元损伤效应研究:ACR（0、50、100、150、200、250 和 500μg/ml）作用单培养SH-SY5Y细胞,染毒24h后0-20μg/ml组细胞相对存活率低于50%;48h时0-150μg/ml组细胞相对存活率低于50%;72h时0-100μg/ml组细胞相对存活率低于50%。抑制率绘制线性拟合图,染毒时间为24h时,R2值最大,线性拟合程度最好,由此,综合考量并设置后续实验染毒时间为24h。HepG2 E47/SH-S Y5Y与HepG2 C34/SH-SY5 Y两组共培养系统,当ACR染毒浓度为0-150μg/ml时,SH-SY5Y的细胞存活率均在50%以下,因此后续实验ACR的染毒梯度浓度设置为0、50、100和150μg/ml、染毒时间为24h。HPLC检测ACR与GA的含量,随着ACR染毒浓度增加（0、50、100和150μg/ml）,两组共培养系统SH-SY5Y细胞中的ACR和GA含量均呈上升趋势,均具有统计学意义（P<0.05）。3 ACR及其代谢产物GA对两组共培养系统中的神经突触结构和功能可塑性损伤效应研究:当ACR染毒剂量为0μg/ml时,SH-SY5Y细胞的神经突触结构清晰,突触间隙明显,可见突触小泡;线粒体圆形或长杆状,线粒体峰结构清晰。随ACR染毒剂量增加,与HepG2 C34/SH-SY5Y共培养组相比,HepG2 E47/SH-SY5Y组突触模糊、结构破坏,突触小泡减少程度增加;线粒体肿胀程度增加,线粒体膜及峭结构消失。两组共培养系统SH-SY5Y细胞中,0、50、100和150μg/ml剂量组的Ca2+-ATPase与Na+-K+-ATPase酶活性渐减少,均具有统计学意义（P<0.05）;HepG2 E47/SH-SY5Y 组的 Ca2+-ATPase 与 Na+-K+-ATPase酶活性下降程度显著高于HepG2 C34/SH-SY5Y组,具有统计学意义（P<0.05）。两组共培养系统SH-SY5Y细胞,0、50、100和150剂量组的Synapsin Ⅰ与GAP-43蛋白渐减少,SNAREs复合体（Syntaxin 1A,SNAP-25,VAMP-2）蛋白渐增多,均具有统计学意义（P<0.05）;HepG2 E47/SH-SY5Y共培养系统中的SynapsinⅠ 与 GAP-43 蛋白明显低于 HepG2 C34/SH-SY5Y 组,Syntaxin 1A,SNAP-25,VAMP-2蛋白明显高于HepG2 C34/SH-SY5Y组,均具有统计学意义（P<0.05）。结论:1、通过携带cyp2e1基因的质粒载体在HepG2细胞系中实现其蛋白持续稳定高表达,并以空载质粒为空白对照,消除质粒对细胞蛋白表达的影响,成功获得CYP2E1过表达细胞株HepG2 E47与阴性对照细胞株HepG2 C34。为深入研究CYP2E1在ACR所致神经毒性及其分子机制中的作用提供有效的细胞模型基础。2、应用HepG2 E47与HepG2 C34为CYP2E1差异化表达的细胞基础,构建肝细胞与神经元共培养模型HepG2 E47/SH-SY5Y和HepG2 C34/SH-SY5Y,研究ACR代谢活化过程对其神经毒效应的影响。3、在ACR所致神经突触结构和功能可塑性损害中,随着ACR染毒剂量的增加,通过电镜观察突触微观结构以及可塑性损伤相关关键功能蛋白SynapsinⅠ、GAP-43 和 SNAREs 复合体（VAMP-2、syntaxin 1A 和 SNAP-25）的改变,推断主要代谢产物GA的损伤作用高于ACR物质原型,此研究结果对ACR神经毒作用机制的最终有效阐明提供了重要的线索和依据。