多房棘球绦虫致病差异与线粒体遗传标志相关性的研究

来源 :石河子大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:s8583527
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目的:泡型包虫病(alveolar echinococcosis,AE)是由多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis,E.m)的幼虫泡球蚴引起的致死性寄生虫病,在肝实质内呈弥漫性浸润生长,被称为“虫癌”。研究表明,泡球蚴病在我国西部省份流行非常严重,AE感染病人占世界患病人数的90%以上。然而,目前还没有有效的疫苗和药物来控制该病,同时宿主感染泡球蚴导致的肝损伤机制目前也不清楚。有研究表明,泡球蚴来源不同,其对人和动物的致病性存在差异;不同源地的泡球蚴感染宿主导致的肝损伤也存在差异,然而目前并不清楚这些差异。因此,本研究以5株不同来源的泡球蚴为研究对象,包括阿拉斯加株(EM-1)、新疆株(EM-2)、日本株(EM-4)、宁夏株(EM-5)和青海株(EM-6),比较不同源地泡球蚴腹腔接种后产生PSCs的差异、致小鼠肝损伤的差异及线粒体(Mitochondria)基因组的差异,试图阐明不同源地泡球蚴致病性差异与进化规律的关系,为进一步了解泡球蚴致病机制奠定基础,为解决上述若干问题,本研究拟通过三个实验来完成:1.建立5株EM的小鼠腹腔感染模型,探讨泡球蚴保种传代的方法,不同株原头蚴(Protoscoleces,PSCs)传代后小鼠体重、肝脏、脾脏和PSCs数量的差异。2.建立5株EM的小鼠肝门静脉感染模型,分析动物感染后肝脏病理变化的差异,外周血Th1/Th2/Th17的之间平衡与抗感染的关联以及致病性最强和最弱的两株转录表达谱的差异。3.运用生物信息学和比较基因组学方法,分析5株EM的不同分类阶元线粒体基因组中分类基因,PCGs基因(Protein Coding Genes)的碱基组成、序列分化、单个蛋白基因的密码子使用、变异率等特征,探讨不同源地泡球蚴线粒体基因的演化模式。方法:1.用5株不同来源的PSCs腹腔接种昆明小鼠各10只,每只5000个PSCs。120天后小鼠称重,处死实验小鼠,计算感染率;包囊称重,分离PSCs,计算PSCs的体积;肝脏、脾脏称重,将感染的脏器用4%多聚甲醛固定,HE染色,100倍下镜检5个视野,计算PSCs平均数;计算包囊重量及PSCs的线性关系。2.小鼠肝门静脉接种5株不同来源的PSCs,每组15只实验小鼠,每只2000个PSCs。120天后小鼠称重,处死实验小鼠并采血;解剖实验小鼠,观察感染情况;将部分感染的肝脏用4%多聚甲醛固定,进行HE和Masson染色,以及免疫组织化学分析,比较不同株之间实验小鼠α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、III型胶原蛋白(Collagen type III alpha I,COL3A1)、细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)的差异;用CBA(Cytometric Bead Array)法检测外周血相关细胞因子(Th1/Th2/Th17)的表达量,比较不同株之间的差异;通过高通量测序技术筛选肝脏区域关键免疫分子在EM-1及EM-4的表达差异,并用实时荧光定量验证筛选的部分差异表达基因。3.提取5株PSCs的基因组DNA,构建文库,Illumina方法进行线粒体基因组测序,并完成线粒体环拼接。使用DnaSPv 5、Mega 6.0、Network 5.0及DNAMAN 5.2.2软件分析各株mtDNA序列的差异,对12个PCGs基因的密码子使用情况和相对同义密码子使用频率(Relative Synonymous Codon Usage,RSCU)进行统计,同时进行核苷酸和氨基酸的遗传距离分析、核苷酸聚类分析、核苷酸及氨基酸与参考基因的变异率及同源性分析。结果:1.不同株PSCs小鼠腹腔接种结果显示,EM-1感染率最高,为87.50%,EM-4最低,为50.00%;产生PSCs数量分别为EM-1(280.00±100.00)>EM-5(183.33±83.33)>EM-2(90.56±55.00)>EM-6(70.00±36.00)>EM-4(40.00±32.00)。肝脏PSCs平均数依次为EM-1(11.52±2.22)>EM-5(8.16±0.83)>EM-2(7.80±0.96)>EM-4(3.80±0.07)>EM-6(1.5±0.45)。包囊重量与包囊内PSCs呈正相关性(r=0.4178,p=0.0241);包囊重量与肝脏内的PSCs呈正相关性(r=0.4946,p=0.0102)。2.不同株的PSCs小鼠肝门静脉接种结果显示,EM-1组实验小鼠成“泡”率最高,达到50.00%,EM-4组的感染症状最轻,未见成“泡”感染;感染强度次序为:EM-1>EM-2>EM-5>EM-6>EM-4。HE染色镜检肝脏病灶数量显示EM-1病灶数最多,EM-4病灶数最少;依次为EM-1(27.58±7.85)>EM-2(24.64±7.97)>EM-5(21.4±5.68)>EM-6(15.36±3.19)>EM-4(15.00±3.00)。Masson染色显示,EM-1与EM-2感染的肝脏纤维化程度与空白对照组(Control,CON)相比差异极显著(P<0.001),纤维化的发生主要以胶原沉积为主,可见明显的纤维化病灶,EM-5与EM-6次之,EM-4最弱,但均与对照组差异显著(P<0.05)。免疫组化结果显示,感染的肝脏病灶周围均有大量的α-SMA及ERK表达,其中EM-1与EM-2组表达量最高,EM-5和EM-6次之,EM-4组最弱,EM-1与EM-2组的α-SMA及ERK表达程度与对照组相比差异极显著(P<0.001)。CBA法检测不同株血清中细胞因子水平,结果显示,EM-1组IL-2值最高,与空白对照组(Control,CON)相比,差异显著(P<0.05),其它组与CON组差异不显著(P>0.05);EM-4组IL-4值最高,与CON相比,差异显著(P<0.05),其它组与CON组相比,差异不显著(P>0.05);所有感染组的IL-6值均低于CON组,EM-4组与CON组差异不显著(P>0.05),其余组差异均显著(P<0.05),;EM-4组IFN-γ值最高,EM-2组与CON组差异显著(P<0.05),其余组差异均不显著(P>0.05);EM-2组TNF-α值最高,所有组与CON组相比均无统计学差异(P>0.05);EM-4组IL-17A值最高,所有组与CON组相比均无统计学差异(P>0.05)(P>0.05);EM-5组IL-10值最高,EM-4组与CON组差异显著(P<0.05),但其它组与CON组相比,差异不显著(P>0.05)。EM-1与EM-4肝脏转录组结果显示,上调基因231个,包含致炎症反应的CD163分子和ATP酶;下调基因350个,包含加重宿主免疫反应的SPN分子。3.线粒体基因组测序结果显示,EM-1、EM-2、EM-4、EM-5及EM-6全长分别为13,740bp、13,737bp、13,737bp、13,738bp及13,740bp。5株线粒体基因组中,亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和丝氨酸等4个氨基酸含量最高,分别为14.88%、13.12%、12.41%和10.32%。对5株线粒体基因组的12个PCGs进行分析,发现ATP6、Cox1、Cox3、Nad1及Nad5氨基酸遗传距离大于核苷酸的遗传距离;Cob、Nad2、Nad3、Nad4及Nad6的核苷酸遗传距离大于氨基酸的遗传距离;Cox2与Nad4l最为保守,氨基酸与核苷酸的遗传距离基本相等,进化最慢。对5株EM的进行遗传距离及Network 5.0分析,均显示EM-1与其他4个株差异较大,与参考基因比较,EM-1的核苷酸及氨基酸变异率高于其他4株,较其他几株同源性略低。结论:1.成功建立了5株不同源地的泡球蚴昆明小鼠实验动物感染模型,并且能够稳定传代。不同源地的泡球蚴对小鼠的致病性存在差异,其中EM-1(阿拉斯加株)感染小鼠后,包囊及肝脏中PSCs的数量最多,其次为EM-5(宁夏株)、EM-2(新疆株)、EM-6(青海株),EM-4(日本株)产生的PSCs数量最少。5株泡球蚴包囊内和肝脏中PSCs的数量与包囊的重量均呈正相关。2.成功建立了不同源地的泡球蚴肝门静脉注射感染动物模型,不同源地的泡球蚴对小鼠的致病性存在差异,其中EM-1致病力最强,EM-4致病力最弱。小鼠感染泡球蚴后,不同株肝脏纤维化程度、病灶周围α-SMA和ERK表达情况、血清中Th1/Th2/Th17相关细胞因子的表达水平均存在差异。对致病力最强(EM-1)和最弱(EM-4)的两株进行的基因表达谱分析,发现231个上调基因和350个下调基因。3.成功对5个不同源地泡球蚴线粒体基因组进行了测序,序列分析结果显示,5株泡球蚴mtDNA全长序列差异很小,但是EM-1株核苷酸和氨基酸变异率高于其它4株,从线粒体基因组分子水平上解析了泡球蚴线粒体基因组结构特点及致病性之间的关系。EM-1的12个PCGs遗传距离与其他4株距离均较远;10个PCGs聚类分析发现EM-1与其他4株距离均较远,EM-1的核苷酸变异率最高,与参考基因比较同源性最低,致病性最强;EM-4的核苷酸变异率最低,与参考基因比较同源性最高,致病性最弱。在12个PCGs中,ATP6、Cox1、Cox3、Nad1及Nad5进化较快,泡球蚴致病力可能与上述5个进化较快的PCGs有关。
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