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果皮颜色是决定苹果市场价值的重要农艺性状。花青苷是决定苹果果实着色的主要色素,其生理合成途径受到许多外界因素的影响,如光照,温度,激素等,尤其是Ultraviolet-B(UV-B)和温度。UV-B通过刺激花青苷合成途径中关键基因的表达来促进花青苷的合成。低温提高了苹果果实的光敏感性,进而促进果实花青苷的积累,保护植物不受氧化和低温伤害。而高温抑制了花青素的合成和积累,最终抑制花青苷的合成。UV-B和温度作为信号分子调控花青苷合成的研究比较多,在其通路中鉴定了很多关键的转录因子,但在果树中UV-B作为信号分子与温度相互作用调控花青苷合成的作用机制尚不清楚。B-box(BBX)蛋白是一类锌指结构转录因子,其结构包含一个或两个B-box结构域。BBX蛋白在植物生长发育的调控网络中发挥着重要的作用。近些年来,关于BBX蛋白的功能研究越来越深入。尤其是在植物光形态建成,控制开花和响应逆境胁迫等方面。BBX转录因子第Ⅳ亚家族有8个成员(BBX18-BBX25),它们在植物光形态建成中的作用机制已被广泛研究。其中BBX21和BBX22正调控光形态建成,BBX24负调控光形态建成。但是它们在UV-B和温度信号通路中的研究相对较少,其调控花青苷合成的作用机理还不清楚。为了进一步挖掘BBX转录因子的功能和其在UV-B和温度信号通路中的作用,本研究以‘烟富3’为试材,通过表达差异筛选,克隆MdBBX转录因子基因,在基因功能验证及挖掘等方面开展研究,主要结果如下:1.在果园搭建试验棚对刚摘袋的果实进行UV-B处理,通过对BBX转录因子第Ⅳ亚家族的8个成员做实时荧光表达量分析进行差异筛选。RT-qPCR结果表明MdBBX20的表达量在UV-B条件下显著上调,而MdBBX24出现了下调的趋势。因此本研究将差异表达显著的MdBBX20和MdBBX24作为目的基因进行进一步的功能验证和挖掘。2.将MdBBX20和MdBBX24分别在苹果王林愈伤和红肉愈伤中过表达,然后在UV-B条件下培养,结果发现与野生型愈伤相比,过表达MdBBX20的苹果王林愈伤会变红,促进花青苷的合成并促进下游花青苷合成结构基因MdCHI、MdDFR和MdANS的表达。而过表达MdBBX24的苹果红肉愈伤会变黄,抑制花青苷的积累并抑制下游花青苷合成结构基因MdDFR、MdANS和MdUFGT的表达。因此MdBBX20能够响应UV-B促进花青苷积累,而MdBBX24在UV-B条件下抑制花青苷的合成。3.通过酵母双杂交实验,双分子荧光互补实验和Pull down实验分别从体内体外验证了MdBBX20和MdBBX24均能够与MdHY5发生互作形成蛋白复合体。通过对其结构域进行分解分析,MdBBX20/24的第二个B-box结构域以及MdHY5的b-ZIP结构域是两者互作所必需的。LUC荧光报告实验结果表明MdBBX20-MdHY5和MdBBX24-MdHY5蛋白复合体中,MdBBX20能够促进MdHY5与MdMYB1启动子的结合,而MdBBX24的作用正好相反。4.通过酵母单杂交,EMSA和CHIP实验验证了MdBBX20能够特异性识别并结合下游结构基因MdDFR和MdANS启动子上的G-box,并促进其表达。而通过酵母单杂交,EMSA和LUC报告实验验证了MdBBX24能够与MdANS和MdUFGT启动子上G-box结合,并抑制其表达。同时LUC荧光报告试验还表明在MdBBX24-MdHY5蛋白复合体中,MdBBX24抑制MdHY5与下游结构基因启动子的结合。5.对MdBBX20启动子上的顺式作用元件进行分析,发现在MdBBX20的启动子上有一个低温响应元件LTR。为了探究MdBBX20在低温信号通路中的作用。将野生型王林愈伤置于低温下处理,结果发现与对照组相比MdBBX20的表达量显著升高。同时将过表达MdBBX20的王林愈伤和野生型王林愈伤放置于不同的UV-B和温度条件下进行培养,结果发现过表达MdBBX20的王林愈伤在UV-B/低温条件下积累的花青苷最多,有趣的是,即使没有UV-B,过表达MdBBX20的王林愈伤只在低温条件下也能积累花青苷。这说明MdBBX20能够响应低温促进花青苷的合成。6.既然MdBBX20能够响应低温,而且启动子序列中还有低温响应元件。通过酵母单杂交实验和EMSA实验结果发现低温响应通路上的重要转录因子MdbHLH3能够特异性识别和结合MdBBX20启动子的LTR顺式作用元件。MdbHLH3在低温条件下表达量也是显著升高的。这说明MdBBX20能够在MdbHLH3的参与下响应低温促进花青苷的合成。7.对MdBBX24启动子上的顺式作用元件进行分析,发现在MdBBX24的启动子上存在一个热激响应元件HSE。同样为了验证MdBBX24与高温信号的关系。将刚摘袋的苹果置于不同温度和UV-B条件下的光照培养箱内进行培养,结果发现MdBBX24的表达量在UV-B条件下下调,在高温条件下上调,但苹果果皮的花青苷含量和花青苷合成结构基因的表达量下降。同时通过酵母单杂交和EMSA实验验证了热激转录因子MdHSF3b/4a能够特异性识别和结合MdBBX24启动子上的HSE顺式作用元件。LUC荧光报告试验结果表明MdHSF3b/4a能够促进MdBBX24的表达量。这说明MdBBX24在MdHSF3b/4a的参与下响应高温抑制苹果果皮花青苷的积累和果皮着色。本研究表明了MdBBX20既能够响应UV-B又能够响应低温,并通过与MdHY5的互作首次阐明了MdBBX20在UV-B和低温信号相互作用下调控花青苷合成的作用机理。同时表明了MdBBX24的表达受UV-B的抑制但能够响应高温来抑制花青苷的合成。