【摘 要】
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海藻多糖种类众多、化学结构复杂,在海洋生物化学循环中被丰富的碳水化合物活性酶分解,形成地球碳循环中最大的循环之一。而海洋生态系统自身就存在最大的海藻多糖裂解酶基因库,即CAZymes基因库。而构成该CAZymes基因库的主要微生物来源是海洋黄杆菌。本课题组分离了大量的能利用不同海藻多糖的海洋黄杆菌。以Tamlana属菌株为研究对象,通过生物信息学分析预测了Tamlana属菌株的海藻多糖代谢途径;并
【基金项目】
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广东省“扬帆计划”培养高层次人才项目、国家自然科学基金（编号:41476150）； 广东高校省级重大项目（编号:2016KZDXM011）； 广东省科技计划项目（编号:2017A020217004）；
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海藻多糖种类众多、化学结构复杂,在海洋生物化学循环中被丰富的碳水化合物活性酶分解,形成地球碳循环中最大的循环之一。而海洋生态系统自身就存在最大的海藻多糖裂解酶基因库,即CAZymes基因库。而构成该CAZymes基因库的主要微生物来源是海洋黄杆菌。本课题组分离了大量的能利用不同海藻多糖的海洋黄杆菌。以Tamlana属菌株为研究对象,通过生物信息学分析预测了Tamlana属菌株的海藻多糖代谢途径;并通过蛋白组学等方法探究了菌株T.laminarinivorans PT2-4水解昆布多糖的分子机制。同时以课题组已有的黄杆菌A.agarilytica ZC1为研究对象,通过对目的基因的原核表达和产物验证等方法证实该菌株中的琼脂糖分解代谢途径。主要获得了如下结果:（1）、从不同地点采集到丰富的大型海藻样品,筛选出近400株菌,其中黄杆菌共24个属80个种。对其中的三株黄杆菌CW2-9、PT2-4和62-3进行鉴定发现菌株CW2-9与T.sedimentorum JCM 19808的16S r RNA基因序列相似度为96.3%,菌株PT2-4和62-3与T.sedimentorum JCM 19808的16S r RNA基因序列相似度分别为98.4%和97.99%;三株菌的主要脂肪酸为iso-C15:0、iso G-C15:1和iso-C17:0 3-OH,呼吸醌为MK6。这三株菌分别被命名为Tamlana fucoidanivorans CW2-9、Tamlana laminarinivorans PT2-4和Tamlana sargassums 62-3。（2）、Tamlana属的菌株根据亲缘关系分析,在基因组水平上明显分为两支。Tamlana sp.EP2-2、T.crocina HST1-43、T.carrageenivorans UJ94、T.agarivorans JW-26和T.fucoidanivorans CW2-9这一支的基因组的保守性较低,水解酶的种类丰富,含有水解甘露聚糖、鼠李聚糖、木聚糖等杂多糖的水解酶。而T.laminarinivorans PT2-4、T.sargassums 62-3、Tamlana sp.S2-14、T.nanhaiensis FHC16和T.sedimentotum JCM 19808这一支保守型较高,具有保守的昆布多糖PUL和海藻酸盐PUL。（3）、T.laminarinivorans PT2-4具有较强的昆布多糖利用能力。通过蛋白组分析和RT-q PCR验证发现菌株PT2-4中的基因1092明显上调表达,重组表达的1092蛋白能将昆布四糖和昆布六糖水解为二糖和单糖;初步阐明了菌株PT2-4中低聚昆布多糖的代谢途径。通过基因截短和定点突变方法,发现基因1092的GH16结构域中Asn364、Arg400和Glu452为基因1092与底物结合的关键结合位点,当它们被替换成丙氨酸,基因1092完全失去了水解昆布四糖和昆布六糖的活性。基因1092的GH16结构域中的Gly361和His466两个位点被替换成丙氨酸后,基因1092的水解产物明显发生变化。（4）、通过菌株A.agarilytica ZC1的胞外寡糖聚合度分析、琼胶酶的信号肽预测、细胞定位预测等,预测了菌株A.agarilytica ZC1中存在的琼脂糖代谢的四个途径。从菌株ZC1中克隆基因Aga575和NH852,并进一步构建了工程菌E.coli Rosetta（DE3）-p ET22b（+）-Aga575-NH852;工程菌水解琼脂糖的产物为不同聚合度的新琼寡糖及3,6-内醚-L-半乳糖和D-半乳糖。
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